胚胎干细胞科大2.pptVIP

胚胎干细胞的分离培养 用于人类ESC研究的胚胎来源 体外受精胚： 由接受辅助生殖治疗的患者夫妇自愿捐献，这些胚胎或配子通过体外培养发育到囊胚。目前已经建立的人Es细胞系，其胚胎均来源于患者自愿捐献。 体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT) 将供体细胞核注入成熟的去核卵母细胞内，激活后的卵子在体外继续发育到囊胚，即技术。目前为止，仍没有采用SCNT技术获得人胚胎成功建立ES细胞系的报道。 小鼠胚胎来源 来自体成熟的自然发情或超数排卵的雌性小鼠 分离建系 胚胎干细胞分离建系的过程 将桑葚胚或扩张囊胚，用机械法或免疫法从囊胚中分离出内细胞团，接种到滋养层细胞，培养几天后，将增殖的内细胞团离散，再接种到新鲜的滋养层上继续生长，经过几代纯化，建立起具有ES细胞特征的细胞系。 分离方法 全胚培养法： 脱去早期胚胎透明带后，将ICM连同滋养层细胞一起置于饲养层细胞上培养，ICM增殖到一定程度后，选择生长集中、细胞团隆起明显的细胞集落，通过显微操作将囊胚ICM与周围的滋养层细胞一同剥离，经胰酶消化后，进行离散、接种，因而该方法又称显微剥离法。 采用该方法已先后分离得到了小鼠 、猪、弥猴的ES细胞以及牛、兔、山羊的类Es细胞。 免疫外科法： 是应用免疫法去除滋养层分离Es细胞的方法。 将无透明带或用0．2％链霉蛋白酶作用3～5 min脱去透明带的囊胚置于抗体中作用30 min ，再转入补体作用30min，然后转移到DMEM中，轻轻吹打，除去溶解的滋养层细胞，然后将纯的ICM转入ES细胞培养液中培养，待其增殖后消化、离散、接种。 优点： 可得到较纯的ICM，培养时不受滋养层细胞的影响。 酶消化法： 用酶消化除去滋养层分离ES细胞的方法。 将无透明带的囊胚置于0.25％胰蛋白酶、 0.04％EDTA的细胞消化液中，在室温下消化约5 min后，在解剖镜下将滋养层细胞开始脱落的囊胚移入培养液中，并借助吸管和拨针分离ICM，然后消化、离散和接种。 优点： 酶消化法分离囊胚ICM细胞的方法较免疫外科法简单，效果也较明显。 建系方法 有饲养层培养体系 目前使用最普遍的饲养层细胞是鼠胚胎成纤维细胞（MEF）及其无限系STO细胞。 还可用卵巢、输卵管、子宫内膜细胞、鸡胎肝成纤维细胞、膀胱癌细胞、子宫颈癌鳞状上皮细胞等作为饲养层培养小鼠ES细胞。 缺点： 如增加了许多操作环节，不容易控制实验条件。 当对Es细胞进行遗传操作时不利于细胞筛选。 不利于对ES细胞进行准确的生化分析。 不利于人ES细胞及其分化细胞用于临床。 无饲养层培养体系 以MEF的条件培养液作为添加成分 在培养液中添加TGFI3、LIF及bFGF，辅助以fibroneetin。 。 目前采用白血病抑制因子(LIF)、大鼠肝脏细胞条件培养基(BRL—CM)、大鼠心脏细胞条件培养基(RH—CM) 等分化抑制剂已经成功地替代了饲养层对小鼠Es细胞进行短期体外培养。 培养基成分 mES 高糖DMEM 培养基 FCS LIF 巯基乙醇 非必需氨基酸 青霉素，链霉素 柠糠酸钠、丙酮酸钠、核苷酸、谷氨酰胺等：为蛋白质台成提供原料和能量。 hES 血清培养液：高糖DMEM 培养基、FBS、巯基乙醇、非必需氨基酸、谷氨酰胺、青霉素、链霉素 无血清培养液：血清代用品+ bFGF 细胞因子 成纤维细胞生长因子（bFGF)： 培养基中加入bFGF，可以改变ES细胞的形态，使之形成小细胞的紧密克隆。当长期培养ES细胞时，在血清中添加bFGF 并不提高克隆效率。但是，在无血清存在的情况下，bFGF的确会提高克隆效率并且持续抑制ES细胞分化。 胰岛素样生长因子(IGF-1)： 不但可以增加细胞中DNA和蛋白质的合成，促进细胞分裂，增加胚胎细胞数，而且对滋养层和ICM 增殖均有促进作用， 人白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor，LIF） LIF具有种属特异性 可维持小鼠ES细胞未分化状态。 单独的LIF对hES细胞的分化并无抑制作用，而MEF饲养层分泌的LIF与人源LIF在结构上存在一些差异，也不能完全抑制hES细胞的分化。因此只有MEF饲养层与LIF同时存在的情况下，hES细胞增殖传代的能力最强。 干细胞因子(Stem Cell Factor，SCF)：作为于细胞生长的调控因子，可提高DNA合成速率，促进于细胞分裂。 腺病毒EIA样激动剂A(Adenovirus E1A Like Acfivity)存在于EC细胞和ES细胞中，它能抑制热休克蛋白基因的转录，抑制