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植物表达载体转化农杆菌操作步骤(转贴)(2008-03-30 16:55:28) 杂谈? 分类：核酸技术 ?植物表达载体转化农杆菌操作步骤第一部分：农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。28℃培养。3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。4、DNA直接转化农杆菌：1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。2天左右菌落可见。（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）2） 小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg ml -1，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml）。3）质粒酶切或PCR鉴定。6、三亲交配法：参考一：1）接种含重组质粒的大肠杆菌于含的LB平板，于37℃培养；（pEmu载体：50μgml -1AMP；pK载体：50μgml -1Kan；pTCK载体：50μgml -1Kan）2）接种含动员质粒pRK2013的大肠杆菌于不含抗生素的LB平板上，于37℃培养；3）接种受体农杆菌EHA105/LBA4404于50μgmL-1 Rif/Str的LB平板上28 ℃培养；4）分别挑取上述平板单菌落，分别于LB液体培养基中震荡培养；5）待三种菌生长到对数期时，各取50μL，混匀，涂布于无抗生素的LB 平板上，28℃培养过夜；6） 挑取长出的小块菌，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养24h；（pEmu载体：50μgml -1AMP＋50μgmL-1 Rif/Str；pK载体：50μgml -1Kan＋50μgmL-1 Rif/Str；pTCK载体：50μgml -1Kan＋50μgmL-1 Rif/Str）7）用接种环将上述培养液划线于含相应抗生素的LB平板，28℃培养至长出单菌落；（pEmu载体：50μgml -1AMP＋50μgmL-1 Rif/Str；pK载体：50μgml -1Kan＋50μgmL-1 Rif/Str；pTCK载体：50μgml -1Kan＋50μgmL-1 Rif/Str）8）随机挑取若干克隆，于含相应抗生素的LB液体培养基振荡培养；9）小量提取质粒DNA进行PCR鉴定。10）将阳性单菌落再次划线纯化。三亲交配法：参考二：1)从保存根癌农杆菌LBA4404的平板上挑取一个单菌落，接种于10m1不含抗生素的LB液体培养基中，28℃ , 200rpm培养24h;2)从保存中间载体的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗生素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养约8h;3)从保存辅助质粒pRK2013的平板上挑取一个单菌落，接种于10ml不含抗生素的LB液体培养基中，37℃ , 250rpm培养约8h;4)分别取以上三种细菌培养物50u1于1.5m1离心管中混匀，取100u!涂布于无抗生素的LB平板上，28℃培养过夜;5)用接种环将长出的菌落转接到含有Kan 50ug/ml,Str 25ug/ml和Rif 25ug/ml的LB平板上，28℃培养过夜;同时各取1, 2, 3步骤中的菌液1