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稻瘟菌激活蛋白基因克隆及表达 　　摘要：以提取的稻瘟菌（Magnaporthe grisea）基因组DNA为模板，PCR扩增出激活蛋白目的基因DW，构建融合表达载体pGEX-KG-DW并进行IPTG诱导表达。SDS电泳分析结果表明，pGEX-KG-DW载体添加IPTG后能在BL21中表达，在68 ku处存在一条特异性带。 　　关键词：稻瘟菌（Magnaporthe grisea）；激活蛋白；克隆；表达 　　中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）19-4807-02 　　激活蛋白是从交链孢菌（Alternaria spp.）、纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、黄曲霉菌（Aspergillus spp.）、葡萄孢菌（Botrytis spp.）、青霉菌（Penicillium spp.）、木霉菌（Trichoderma spp.）、镰刀菌（Fusarium spp.）等多种真菌中筛选、分离、纯化出的一种新型蛋白[1]。其蛋白分子质量为42 ku，等电点为4.8[2]，能诱导多种植物产生系统抗性，促进植物生长，改善作物品质，可作为一种新型的广谱、高效、多功能的生物农药[3]。稻瘟病是由稻瘟菌（Magnaporthe grisea）引起的真菌病害[4]。从稻瘟菌中提取出的激活蛋白称稻瘟菌激活蛋白[5]，该蛋白能明显促进植物的发芽、生长、抗逆[6]。研究表明，经过激活蛋白处理后，水稻幼苗可增加对稻瘟菌的抗性[7]。植物激活蛋白也能干扰烟草花叶病毒外壳蛋白的体外聚合过程[8]。大田试验证明激活蛋白处理后植物抗病率高达70%以上[9]。激活蛋白具有无公害、无残留、无污染等特征，既可作为植物生长调节剂，又可作为生物农药用于农业生产[10]。本研究通过构建稻瘟菌激活蛋白表达载体，并在大肠杆菌中实现该基因的高效表达，以期为产业化生产该蛋白提供一定参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　稻瘟菌北1-24，由中国农业科学院作物科学研究所提供；化学诱导型表达载体pGEX-KG，由中国农业科学院植物保护研究所分子生物学实验室保存；pMD18-T载体，购于天根生化科技（北京）有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.4 融合表达载体的构建及在大肠杆菌中表达 　　1）以DW1和DW2为引物，pMD-18-DW为模板，PCR扩增稻瘟菌激活蛋白基因片段并连接至pGEX-KG载体上。将鉴定正确的pGEX-KG-DW质粒转化大肠杆菌BL21。 　　2）将大肠杆菌BL21重组菌pGEX-KG-DW接种于5 mL LB液体培养基（含50 μg/mL氨苄青霉素），37 ℃、200 r/min振荡培养12 h。然后以1∶100的比例转接于5 mL LB液体培养基（含50 μg/mL氨苄青霉素），37 ℃、200 r/min振荡培养至对数生长期（约2～3 h），加入0.5 mmol/L IPTG，37 ℃、200 r/min振荡培养，进行诱导表达。分别在2、4、6、8、10 h进行取样，SDS电泳检测。 　　2 结果与分析 　　2.1 稻瘟菌基因组DNA的提取及序列分析 　　提取了日本稻瘟菌基因组DNA，以基因组DNA为模板，PCR扩增激活蛋白基因，以1%琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。PCR扩增得到1条大小为1.6 kb的片段，并送至上海申能博采生物技术公司进行测序，同源性为100%。 　　2.2 融合表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达 　　经序列测定，克隆载体pMD-18-DW插入片段中引入的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性内切酶位点、起始密码子、终止密码子和读码框正确。BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pMD-18-DW，回收目的片段与pGEX-KG载体连接，构建融合表达载体pGEX-KG-DW，转化大肠杆菌BL21。 　　结果（图2）表明，0.5 mmol/L IPTG诱导目的蛋白在大肠杆菌BL21中表达。泳道1为连有目的蛋白的载体不加诱导物在BL21中的表达，结果显示没有特异性带；泳道2为连有目的蛋白的载体添加IPTG后能在BL21中的表达，在68 ku处存在一条特异性带。以上诱导时间均为5 h。 　　3 小结与讨论 　　本研究利用PCR扩增出1.6 kb的基因片段，然而从稻瘟菌基因组全序列分析推断出的激活蛋白基因大小只有1.0 kb，基因组DNA由于含有内含子，扩增得到1.6 kb的片段是正常现象。稻瘟菌激活蛋白基因在融合表达载体中可以正常表达，但表达量较低，最佳的诱导条件有待于进一步优化选择。本试验同时也研究了激活蛋白非融合表达载体pBV221的构建及表达，结果重组非融合蛋白无法表达，具体原因不是很清楚，推测可能是由于此蛋白对大肠杆菌有毒性，这方面内容也有待于进一步