2004-10-10175903结核病实验室诊断技术进展.pptVIP

结核病实验室诊断技术进展 一、细菌学方面 1、????????? 荧光镜检法检查抗酸杆菌： 可提高工作效率；提高检出率 镜检观察视野以60视野为宜，避免造成假阴性且可提高工作效率3－5倍，荧光镜检（直接涂片）法优于抗酸镜检（直接涂片及集菌）法。 2、BACTEC460自动检测系统 利用分枝杆菌在液体培养基中能早期微量生长的原理，采用放射技术，在 含有14CO2，仪器能自动测定其脉冲数，即结核菌生长指数以GI表示，当GI达到50－100时进行涂片抗酸染色证实是否抗酸杆菌并观察是否呈索状生长。并以NAP培养基进行结核菌和非结核分枝杆菌鉴定。 也可在含有14C棕榈酸培养基中加入适当浓度的抗结核药物，将定量的结核菌接种在内并与不含药物的对照管比较14CO2产生量，快速测定药物敏感性。BACTEC460系统初代分离培养阳性率较罗氏培养法提高10％左右，报告时间明显缩短。初代分离培养、菌种鉴定、药敏试验三方面累计平均缩短65.7天。药敏试验与常规方法的符合率为95－100％，但此法存在放射性环境污染，费用昂贵，不易普及。 3、BACTEC960全自动分枝杆菌检测系统 采用最先进的荧光增强技术，在Midcllebrook Th9培养基的试管底部包埋对氧浓度变化高度敏感的荧光显示剂，当管内有分枝杆菌生长，管内氧浓度下降时管底荧光显示剂在特定光源激惹下释放荧光。阳性检出率比罗氏法提高10.77％，比BACTEC460相同。不能进行菌种鉴别，无放射污染。 4、噬菌体裂介法快速鉴定结核分枝杆菌 原理：分枝杆菌噬菌体只能感染相应的活分枝杆菌。如待检标本种有相应的活分枝杆菌，则噬菌体侵入体内，免遭杀毒剂破坏，并在菌体内大量增殖，最终裂解菌体释放出噬菌体，感染指示细胞，使指示细胞裂解，出现噬菌斑。如待检标本中无相应分枝杆菌，噬菌体被加入的杀毒剂全部杀死，后加入的指示细胞不受感染，能在培养皿中生长繁殖，无噬菌斑出现。18－24小时既可观察结果。本法具有快速诊断价值，其敏感性3*102－103条/ml（300－1000条菌/ml）结核分枝杆菌，特异性100％。 5、结核菌的L型培养 结核分枝杆菌L型使在不利的体内外环境中受到物理、化学包括药物及免疫因素影响，细菌的生物学性状发生改变，细胞壁缺陷，呈圆形颗粒状，抗酸染色消失，改良罗氏培养基中不能生长。但L型菌可引起病程慢性化，易复发是引起难治的主要原因。所以对涂阴肺结核特别对慢性难治性结核病人进行L型菌培养，对病人的诊治预后判断及流行病学调查都有重要的实用价值。目前L型培养基有改良胰胨大豆蛋白琼脂培养基和快速蛋白胨琼脂牛（羊）血清培养基。 6、分子生物学检测技术 ⑴核酸探针：用于测定待检菌核酸同源性序列的标记核酸片断或序列。结核菌和非结核分枝杆菌的核酸探针有C-DNA探针；全染色体核酸探针；克隆核酸探针和寡核苷酸探针。主要用于分离株的快速鉴定（经培养分离得的菌株），其特异性与敏感性均达到100％，有助于结核病的诊断和鉴别诊断。但核酸探针技术存在检测灵敏度低，在临床技术中有104－105菌体细胞/ml才能呈现杂交阳性反应。 ⑵聚合酶链反应（PCR）：由一对特定的寡核苷酸引物介导的某特定核酸序列体外酶促扩增技术。经过变性－复性－延伸三阶段数十个循环后，目的序列拷贝数可增加数百万倍，达到毫微克水平，很易经琼脂扩散电泳检出。它具有灵敏度高，特异性强，无需培养，快速检出和鉴定的优点，特别使用于难以分离培养和生长缓慢的病原微生物的检出和鉴定。但在实际应用中存在假阳性、假阴性影响PCR可信度，同时对PCR检测的结果的意义存在不同程度的疑惑。加上商业试剂质量上的问题和抄做技术上缺乏标准化等等，1998年卫生部明令禁止PCR技术在临床上的常规应用。 特异性强的DNA探针与灵敏度高的PCR技术二者结合已成为我们对结核病诊断进行研究的良好途径。近年来PCR技术发展到能对靶基因的数量（定量PCR）进行检测。有其是性发展起来的荧光定量及时，其灵敏度较定性PCR和早期帝国两PCR明显提高。同时由于特异性探针的引入，在测定阶段去除一些非特异性扩增产物，这无疑提高了检测的特异性。但由于定量PCR技术在结核分枝杆菌的检测方面报导少，尚不能对该技术的临床检测作出客观的评价，有待进一步探讨。 ⑶核酸指印（指纹）技术：是一种利用直接观察的细菌染色体的限制性内切酶酶切诊断特征性带谱，鉴定分离株的基因诊断技术。利用分子探针与分析结核菌限制性内切酶切片长度及形性（RFLP）隐蔽无同源诊断，突出了特征性诊断，大大减少了供辨认诊断，便于指印认证。可以进行结核菌复合群内各种的鉴定和株间鉴定。成为流行病学群体遗传学分析的有力工具，对于暴发流行时传染源的追踪