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盐地碱蓬愈伤组织原生质体分离纯化 　　摘 要：探索了盐地碱蓬愈伤组织原生质体提取过程中所需要的酶浓度及其比例、最适甘露醇浓度，以得到最佳盐地碱蓬原生质体的纯化方法。结果表明，原生质体分离的最佳条件是：甘露醇0.7 mol/L、纤维素酶3.0%、离析酶1.0%和果胶酶0.2%。 　　关键词：盐地碱蓬；愈伤组织；原生质体；分离纯化 　　中图分类号：Q949.745.102 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）12-0024-04 　　Isolation and Purification of Suaeda salsa Protoplast from Callus 　　Han GuoLiang， Yang JianChao， Sui Na* 　　（College of Life Science， Shandong Normal University/Shandong Key Laboratory of Plant Stress Research， Jinan 250014， China） 　　Abstract The optimal enzyme prescription and mannitol concentrations for protoplast extraction from Suaeda salsa callus were tested in this paper， and also the optimum purification method. The results showed that the optimum conditions for protoplast separation were 0.7 mol/L mannitol， 3.0% cellulose， 1.0% macerozyme and 0.2% pectolase. 　　Key words Suaeda salsa L. ； Callus； Protoplast； Extraction and purification 　　盐地碱蓬（Suaeda salsa L.）是典型的稀盐盐生植物，主要分布在欧洲和亚洲，我国东北、西北、华北及沿海各省的盐碱地均有分布，在海滩以及盐湖边形成单优群落[1]。盐地碱蓬是真盐生植物中一种良好的研究材料，目前其耐盐的生理机制研究已经取得较大的进展，克隆了HKT1、NHX1和 SAM等耐盐基因，初步揭示了稀盐盐生植物在液泡水平离子区域化提高耐盐性的机制[2，3]。由于不清楚盐地碱蓬的遗传背景，虽然再生体系已经有所突破，但仍然无法对其进行常规的遗传转化，无法将这些基因在盐地碱蓬中进行过量表达或者沉默来更深入研究耐盐的分子及机理[4]。将原生质体作为遗传转化体代替常规的外植体，通过PEG介导、农杆菌培养共转化以及电击穿孔等转化方法获得转化植株[5]，可以为遗传转化体系建成提供新的思路，目前已经在马铃薯等高等植物的原生质体中获得转化植株[6]。 　　成熟的盐地碱蓬细胞，中央液泡发达，原生质体容易破碎，在原生质体培养和细胞全能性上不如愈伤组织[7]。植物原生质体的纯化一般联合运用过滤法、离心法和漂浮法，经过较长??间的发展，原生质体的分离方法越来越完善。目前以纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶配合的酶解分离法成为最成熟的方案，已经在洋葱、扁蓿豆、沙葱等植物的愈伤组织中成功提取原生质体[8～10]。本研究利用盐地碱蓬愈伤组织获得原生质体，探索其原生质体提取过程中所需要的各种酶浓度及其比例及最适甘露醇浓度，得到最佳盐地碱蓬原生质体的纯化方法，为利用原生质体建立遗传转化体系奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　盐地碱蓬种子于2011年11月采自中国东营黄河三角洲自然生境盐碱地，晾干后去掉果皮储存于4℃冰箱备用。 　　1.2 试验方法及处理 　　1.2.1 愈伤组织的诱导 盐地碱蓬种子先用70%（V/V）的乙醇消毒5 min，接着用3.6% NaClO消毒15 min，无菌水冲洗5～6遍，接种于无激素的MS培养基上（pH 5.8～6.0），在温度为（25±2）℃、相对湿度75%条件下培养10天，获得无菌苗[11]。取生长10天的无菌苗的下胚轴（直径约为0.1 cm）剪成长0.5～1.0 cm的小段，接入愈伤组织诱导培养基（MS+0.5 mg/L 2， 4-D+1 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA）暗培养28天后得到白色的愈伤组织[12]，作为酶解的原材料。 　　1.2.2 原生质体的分离 收集盐地碱蓬愈伤组织，分别放入用磷酸缓冲液（取0.2 mol/L NaH2PO4·2H2O 87.7 ml 和0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O 12.3 ml