酵母rna的提取鉴定和定量测定实验十课件.pptVIP

取两支离心管，向第一支管中加入2 ml样品溶液和2 ml蒸馏水。第二支管中加入2 ml样品溶液和2 ml沉淀剂。混匀。 在冰浴中放置30分钟，然后离心10分钟，3000转/分钟。 从各管中取出0.25 ml上清液，用蒸馏水定容到25 ml。 于260nm处测定其光吸收值（OD1、OD2） 将样品放于紫外分光光度计上测定260nm, 计算核酸浓度。 OD1—OD2 RNA% = 0.022 ×100  样品浓度  式中：OD260为260nm波长处光密度读数；L 为比色杯的厚度；0.022为每毫升溶液内含1微克RNA的光密度。 RNA的鉴定三：提取的RNA吸收光谱测定 核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260 nm附近。不同的核酸有不同的吸收特征。所以可以用紫外分光光度计加以定性和定量。 操作: 取RNA的定量分析之二所配溶液0.5 ml,稀释200倍,取3 ml测定不同波长(230、240、250 260、270、280、290、300、310 nm)下的OD值,以不同波长为横坐标, OD值为纵坐标绘制RNA吸收光谱曲线。 RNA的鉴定四：提取的RNA纯度的判断 纯DNA的 OD260/OD280 应大于1.8，而纯 RNA的 OD260/OD280应达到2.0。如果样品中含又杂蛋白、苯酚，则OD260/OD280的比值会明显降低。所以我们通过测定OD260/OD280的比值来检测RNA的纯度。 操作: 取RNA的定量分析之二所配溶液0.5 ml,稀释200倍,取3 ml于比色皿中分别在260nm、280nm处测定其光吸收值（OD1、OD2） 根据测得的OD值判断提取的RNA的纯度。  剂i] 1、推入黑体遮光预热 2、 在 “T” 位置调 “0” 3、在 “T” 位置调 “100” 4、按到 “A” 位置测定 UV-2000 RNA的鉴定之二：醋酸纤维素薄膜电泳分离鉴定 1、RNA的碱水解： 称取0.15克RNA，溶于5 mL 0.3 mol/L氢氧化钾溶液中，使RNA的浓度达到20-30 mg/ml。沸水浴30 min 或者在37℃水解18个小时。将水解液转移到椎形瓶中。冰浴中用高氯酸溶液将水解液滴定到pH3.5。2000r/min 离心10 min，上清液即是样品液。 ２、准备与点样 (1)将薄膜切成2.5 cm×8 cm的小片。在薄膜无光泽面(正面)的一端约2 cm处用硬铅笔划一点样线。 (2)将薄膜无光泽面向下，置PH 3.5,0.02 mol/L的柠檬酸缓冲液中浸湿。 (3)将充分浸透的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓冲液，把膜条置洁净玻璃板上，无光泽面朝上。用点样器在距膜条一端2-3cm处点样。 醋酸纤维薄膜电泳装置示意图 1. 滤纸桥 2. 电泳槽 3. 醋酸纤维素薄膜 4. 电泳槽膜支架 5. 电极室中央隔板 3．电泳 将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时，无光泽面(即点样面)向下，点样端置于负极，槽架上以双层滤纸作桥垫，滤纸的一端与支架的前沿对齐，另一端浸入电极槽的缓冲液中。用缓冲液将滤纸全部浸润并驱除气泡。膜条与滤纸需贴紧，待平衡5 min后通电，电压为160 V，电流为0.4～0.7 mA/cm，通电30 分钟左右关闭电源。 4．记录结果 通电完毕后用镊子将薄膜取出，于紫外灯下观察，用铅笔将吸收紫外光的暗斑圈出。 在实验报告上绘出RNA水解液的醋酸纤维素薄膜电泳图谱，并分析确定各斑点代表那种核苷酸。 注意事项 （1）市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。若飘浮于液面的薄膜在15－30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳。 （2）醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥－巴比妥钠缓冲液，其浓度为0.05－0.09mol/L。选择何种浓度与样品和薄膜的厚薄有关。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，区带扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，不易分辨。 （5）电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4－0.6