超声萃取—同位素稀释液相色谱—质谱法检测血清中氢化可松.docVIP

超声萃取—同位素稀释液相色谱—质谱法检测血清中氢化可松 　　摘 要：建立了液相色谱-质谱检测血清中氢化可的松含量的方法。血清加内标后平衡30 min，加乙腈除蛋白，将混合液超声10 min，再以3000 r/min离心15 min，取出上清液用氮气吹干，用水复溶后，以相同体积乙酸乙酯萃取两次，将两次萃取的乙酸乙酯合并，氮气吹干，然后用200 μL流动相复溶，液相分离采用Zorbax Eclipse Plus C18 色谱柱，流动相为甲醇和含0.1%甲酸的水溶液（43∶57， V/V），日间和日内标准偏差分别为0.3%～0.7%和0.3%～0.6%，回收率为99.6%～101.0%，定量限为1.68 μg/kg。运用本方法检测了3种人体血清中氢化可的松含量，并研究了血清中氢化可的松的稳定性。 　　关键词：氢化可的松； 同位素稀释； 液相色谱-质谱； 超声萃取； 血清 　　1 引 言 　　氢化可的松是一种重要的肾上腺皮质激素[1]，在体液循环中大部分与蛋白质键合。其主要参与碳水化合物代谢，具有阻碍周围组织中蛋白质合成和促进免疫力的功能[2]，同时参与控制人体新陈代谢速率和个体生长。异常的氢化可的松含量会导致多种疾病，比如阿狄森氏病、库氏综合症和糖尿病等[3]。因此准确测量血清中氢化可的松含量对于监测甾体激素的产生过程和人体健康有重要意义。 　　关于血清中氢化可的松检测的方法很多，早期主要采用免疫分析法[4，5]，但测量结果假阳性偏多[6]。近年，大量关于使用液相色谱（LC）[7～9]，气相色谱-质谱（GC-MS）[10，11]和液相色谱-质谱（LC-MS）[12，13]的分析方法多有报道。多运用固相萃取（SPE）去除蛋白，分离血清中目标物，取得了一定的效果，但是这些方法往往前处理时间较长，实验消耗昂贵，而且需要较高的实验技巧。为了解决这些缺点，本研究采用超声结合乙酸乙酯液液萃取的方法分离血清中氢化可的松。超声波是一种特殊形式的能量，其在溶液中产生的冲击波和微热流能显著增加待分析物的活性，多用于药物分析，但用于血清中激素的分析还未见报道。同位素稀释质谱法是指将目标物的同位素标记加入待测样品中，与目标物充分混合，通过加入的标记的量及质谱检测的目标物及其同位素标记的丰度比来计算目标物含量的方法。在目标物???其同位素标记达到平衡后，同位素的丰度比既已恒定，混合后的样品在进行元素分离、浓缩、转移、萃取等操作过程中，即使发生丢失，也不会改变同位素组成，避免了由此带来的测量误差。本实验表明，超声萃取可增加氢化可的松从蛋白和血清中分离效果，使用超声波结合液液萃取，大大降低了实验消耗，缩短了前处理时间，经过同位素稀释，进行液相色谱质谱分析，方法准确可靠。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　6410三重串联四极杆质谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；氮吹仪（美国Organomation公司）；Mill-Q Academic纯水处理系统（法国Milli Pore公司）；CP324S电子天平（德国Sartorius 公司）；台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；Touch Mixer MT-51涡旋振荡器（日本Yamato公司）；Branson 5510超声波清洗机（美国Branson 公司）。 　　2.2 液相色谱条件及质谱条件 　　2.2.1 液相色谱条件 安捷伦1200高效液相色谱仪，Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱（150 mm×2.1 mm i.d.， 3.5 μm）；流动相A为甲醇，流动相B为0.1%甲酸溶液，两相比例为43∶57；柱温：25 ℃；样品盘温度：4 ℃；流速为0.25 mL/min。 　　2.2.2 质谱条件 安捷伦6410三重串联四极杆质谱仪，ESI源，正离子模式。其它质谱参数：干燥气流速12 L/min、喷雾电压413.7 kPa、毛细管电压3500 V、碰撞能10 V、碎裂电压130 V。整个质谱检测时间6 min，溶剂延迟1 min。 　　2.3 实验方法 　　2.3.2 血清样品的处理 将200μL血清加入1 mL安培瓶内，并称量血清质量，加入适量的氢化可的松同位素标记的工作标准溶液，并称量其质量。加标血清在常温下平衡30 min后，加入400 μL乙腈除蛋白，将混合液在超声机上超声10 min，再以3000 r/min离心15 min，取出上清液在40 ℃水浴下氮气吹干，用200 μL水复溶后，以相同体积乙酸乙酯萃取两次，将两次萃取液合并，在40 ℃下氮气吹干。然后用200 μL流动相复溶，充分涡旋以保证完全溶解。所有复溶液在用LC-MS/MS分析前都要经过0.22 μm 滤膜过滤，分析进样量为10 μL。 　　3 结果与讨论 　　3.1 萃取条件的优