原位杂交2(修改稿.pptxVIP

二、? 固定 在固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面，即保持良好的细胞结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平及使探针易于进入细胞。 ;（一）固定剂 化学固定剂有沉淀固定剂和交联固定剂两类。常用的沉淀固定剂有乙醇和丙酮等，经用沉淀固定剂固定的组织通透性较好，利于探针穿入组织。但沉淀固定剂可能引起RNA的丢失，而且组织的形态结构保存也不十分理想。 ; 交联固定剂有多聚甲醛、戊二醛等。醛类交联固定剂可较好地保存组织中的RNA，对组织形态结构的保存也优于沉淀固定剂。但由于戊二醛这样的强交联固定剂固定后的组织通透性很低，探针较难进入其中。一般认为，4％多聚甲醛对检测mRNA的组织固定较为理想，它既能有效地保存靶组织的形态结构，又可使组织具有一定的通透性。 ;（二）固定方法 先行灌注固定，然后取材并将取下的组织浸入固定液中再行浸渍固定。经固定和漂洗后的组织也可在15％蔗糖磷酸缓冲液中于40C下保存1～2个月。新鲜组织也可以在取材后直接以液氮或干冰速冻，冰冻切片后再浸入4％多聚甲醛固定10～30分钟，干燥后立即进行杂交或保存在-700C冰箱内。如果冰箱温度恒定，可保存数月之久。 ;三、 切片 在原位杂交中，以冰冻切片最常用。在切片时，要尽量避免RNA酶污染，操作时要戴手套，用70％酒精或10％SDS擦洗工作台、切片机刀架、摇柄和载物台等手常接触的部位以及其它器械。切片厚度可根据具体情况而定。如靶组织中待测mRNA的量较少，所采用的原位杂交技术敏感性较低，为了能得到较多的信号，切片可厚些（约15～20μm），反之，则可薄一些（约5～10μm）。 ; 如果细胞直接生长在载玻片或盖玻片上，则可将长有细胞的载玻片或盖玻片直接固定，再按上述方法漂洗、干燥、储存。 ; 第四节? 杂交前处理 杂交前处理主要包括增强组织的通透性、减低背景染色两个方面。 一、增强组织的通透性和核酸探针的通透性 增强组织通透性常用去污剂或某些消化酶处理，通过这种处理，可广泛地去除蛋白质而增强组织的通透性和探针的穿透性。 ; 常用的去污剂是Triton-X100，一般都将切片浸入含0.2～0.5% Triton X-100的PBS内15min 。 蛋白酶K的消化作用在原位杂交中十分重要。 蛋白酶K还具有消化包围靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。 ; 二、 减低背景染色 （一）?酸酐和稀酸处理 稀酸处理能使碱性蛋白变性，如再结合蛋白酶消化，即可将碱性蛋白移除，这样不仅能增强靶核酸探针的可及性，也可避免碱性蛋白与核酸之间的非特异性结合，达到解降低背景的目的。 ;（二）预杂交 以阻断标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到减低背景染色的目的。 （三）内源性生物素和酶的抑制 组织中内源性生物素、过氧化物酶或AKP则应事先阻断。 标本可用不标记的卵白素－生物素孵育，以阻断内源性生物素。 ; 适宜的杂交前蛋白酶消化有利于消除内源性生物素的干扰。 用5％脱脂奶粉缓冲盐液来稀释标记的卵白素以及将标记标本浸于含2％牛血清白蛋白的缓冲液，均可防止或抑制标记的卵白素与组织标本之间的非特异性结合。 ; 第五节?????杂交反应 杂交液的成分与预杂交液基本相同，所不同的是加入了标记的核酸探针。杂交前的准备只是为杂交的成功奠定基础。 ;一、 双链DNA探针和靶DNA变性 进行杂交反应时，探针与靶核酸都必须是单链。 探针和靶核酸一旦变性，要马上进行杂交反应，否则，解链的核酸又会重新复性。 如果用单链探针检测靶RNA，一般不需变性。;微波炉处理不仅能使双链的探针和靶核酸有效地变性，而且还能使杂交信号增加。 二、杂交液 杂交液内除含一定浓度的标记探针外，还含有较高浓度的盐、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及载体DNA和RNA等。 Na+可使杂交率增加，还可减低探针与组织标本之间的静电结合。 ; 甲酰胺可使Tm值降低； 硫酸葡聚糖能与水结合，从而减少杂交液的有效容积，提高探针有效浓度，以达到提高杂交率的目的。 牛血清白蛋白及载体DNA或RNA等，都是为了阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背景。 ;三、探针的长度 探针的最佳长度应在30～100碱基之间。探针短，易于进入细胞，杂交率高，杂交时间短。 四、探针的浓度 探针的浓度远比组织中靶核酸的浓度要高。一般为0.5～5.0μg/ml，通常建议放射性同位素探针浓度为0.5μg/ml，非放射性探针为2μg/ml。 ; 过量的杂交液含核酸探针浓度过高，