小麦成熟胚脱分化过程中MADS—box家族基因表达分析.docVIP

小麦成熟胚脱分化过程中MADS—box家族基因表达分析 　　摘 要：利用小麦成熟胚脱分化基因芯片对脱分化过程中MADS-box家族基因的表达变化进行研究，检测到MADS-box家族转录因子基因及其靶基因共19个，上调表达基因3个，下调表达基因12个，混合表达基因4个，其中，CA730918、CK213813、BE417035、BJ276784、CA726603可能在小麦脱分化过程中意义重大。利用半定量RT-PCR技术对CA670406、CK213813、CA679889、AB107992和BJ228622基因的表达变化进行验证，结果与基因芯片检测结果相似。 　　关键词：MADS-box家族；转录因子基因；脱分化；基因芯片 　　MADS-box名称来源于4种MADS-box基因的首字母[1]，这4种基因分别为酵母的MCM1[2]，拟南芥的AG[3]，金鱼草中的DEFICIENS[4]和人类的SRF[5]。MADS盒与识别特异的DNA序列有关，编码该区域的基因被统称为MADS-box基因[6，7]。MADS-box基因是一类序列特异的调节基因家族，它编码的MADS-box蛋白为转录因子，主要功能是激活或抑制基因的转录反应。近年来，人们对小麦MADS-box基因功能的研究逐渐增多。研究发现，TaVRT-1具有调节小麦营养生长向生殖生长转变的功能，该基因Vrn-1区域与春化处理和耐冬性有关，在春化诱导的植物中表达[8]。WAG是小麦中分离出的一个与AG同源异型的基因，该基因在幼穗中表达水平低，随着穗的发育逐步增加，在孕穗期到抽穗期表达水平最高[9]。随着研究的深入，部分基因已被克隆出来。人们从小麦中分离出两个与心皮化有关的基因WPI1和WPI2，这两个基因在小花的浆片原基和雄蕊原基中表达[10]。Yan等克隆了两个与开花结实相关的基因VRN1和VRN2[11，12]，其功能分别类似于拟南芥分生组织基因AP1和AGL2。尽管对小麦MADS-box基因的研究逐渐增多，但其在成熟胚脱分化过程中的研究尚未见报道。 　　本试验对小麦成熟胚进行脱分化处理，利用基因芯片技术检测了脱分化期间部分MADS-box转录因子基因及其调控基因的表达状况，并对基因芯片的可靠性进行验证，为探索MADS-box基因在小麦成熟胚脱分化过程中的作用提供依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料处理 　　在超净工作台上，剥取普通小麦品种豫麦18成熟胚，置于MS+2，4-D（2 mg/L）培养基上培养[13]，根据小麦成熟胚脱分化过程中外部形态???内部结构的变化，分别于脱分化0、2、6、12、24、72 h时取样，液氮处理后-80℃保存备用。 　　1.2 总RNA提取与纯化 　　按Invitrogen公司的Trizol试剂盒使用说明提取总RNA，并用QIAGEN公司的RNeasy mini试剂盒纯化，1%琼脂糖凝胶电泳（180 V，0.5 h）检测总RNA的28S和18S比例（亮度约为2∶1时提取效果最好），260/280 nm波长下测定总RNA的吸光值，计算其浓度和纯度。 　　1.3 基因芯片检测 　　1.3.1 cDNA和cRNA的合成及纯化 合成cDNA时，总RNA模板量为1～8 μg；合成生物素标记的cRNA时，取12 μl上述cDNA溶液为模板。cDNA、cRNA的纯化按基因芯片分析样品纯化操作程序进行[14]。两者的浓度、纯度和质量检测方法同上。 　　1.3.2 cRNA片段化和杂交 取15 μl浓度为1 μg/μl的cRNA，加6 μl 5×片段化Buffer和9 μl RNase-free水混匀，94℃温浴35 min，得到长度为35～200 bp的cRNA片段。按Affymetrix公司提供的配方配制杂交液，将杂交液加至经预杂交处理的Affymetrix Wheat Gene Chip中，45℃、60 r/min杂交16 h，吸去杂交液，用Gene Chip全自动洗涤工作站450（Affymetrix 公司，USA）对芯片进行洗涤和染色芯片。 　　1.3.3 芯片检测参数的获取 高分辨芯片扫描仪3000（Affymetrix公司，USA）扫描芯片，获得基因表达信号值[15]。用GCOS1.2软件读取、处理信号值数据，获得归一化后的信号值、信号检出（P， A， M）以及试验组和对照组的比值。 　　1.3.4 MADS-box家族基因的确认 利用NCBI（http：///）、DATF（http：///）和DRTF（http：///）等网站拟南芥和水稻等植物数据库查找MADS-box家族基因名称，然后在小麦基因芯片上查找对应的名称，并获取各点的荧光信号值。以不同时间点的表达信号值除以0 h表达信号值（对照）并取以 2 为底的对