石榴F3’H基因PCR反应体系研究.docVIP

石榴F3’H基因PCR反应体系研究 　　摘要：从石榴（Punica granatum L.）泰山红品种的花瓣中提取总RNA并反转录得到cDNA。设计简并引物对石榴类黄酮3’-羟化酶（F3’H）基因进行PCR扩增，筛选合适的引物及退火温度。结果表明，适合石榴F3’H基因扩增的正反向引物分别为5′-CGTNGAYGTBGTBGTBGCSKCVTC-3′，5′-TCHCCDGCWATGGCCCAHAYRTT-3′。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；72 ℃保温10 min。 　　关键词：石榴（Punica granatum L.）；F3’H基因；PCR 　　中图分类号：S685.99 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）09-2168-03 　　石榴（Punica granatum L.）为石榴科落叶灌木或小乔木，在中国已有两千多年的栽培历史，在长期的自然选择和人工栽培过程中形成了丰富的遗传多样性[1，2]。石榴不仅是人们喜爱的传统水果，也是一种优良的园林绿化树种。石榴花朵艳丽，其花瓣有单瓣、复瓣、重瓣、台阁等不同花型，红、粉红、白、黄等不同花色[3]，观赏价值极高。目前对石榴AFLP[1，2]、ISSR[4]、RAPD[5]、SARP[6]等分子标记的研究较多，而对控制石榴花色形成相关基因的报道较少。类黄酮3’-羟化酶（F3’H）属于细胞色素P450单加氧酶家族，在花色苷生物合成途径中发挥重要作用，具有催化多种依赖NADPH或NADH的底物氧化反应的功能[7]，可将4’，5，7-三羟基黄烷酮（Naringenin）和二氢堪非醇（Dihydrokaempferol， DHK）分别转化成圣草酚（Eriodictyol）和二氢栎精（Dihydroquercetin，DHQ）后形成不同颜色的花色苷，使植物表现出不同的花色[8]，克隆F3’H基因可为研究石榴的花色形成提供分子基础。本研究以石榴泰山红品种的花瓣为材料，对F3’H基因的PCR扩增条件进行优化，从而建立高效特异的石榴F3’H基因PCR扩增体系，为后续石榴花色形成机理研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　于2012年5～6月从山东省果树研究所石榴种质资源圃采集泰山红石榴的花瓣，放入液氮速冻后放入-80 ℃冰箱中保存备用。 　　1.2 方法 　　2 结果与分析 　　2.1 总RNA的提取结果 　　2.2 引物对的筛选 　　2.3 退火温度的优化 　　3 讨论 　　PCR是基因分离、克隆和核酸序列分析等分子生物学研究的基础，影响PCR产物特异性和得率的因素很多[9]，如退火温度、退火和延伸时间、引物和酶的浓度、Mg2+的浓度等，所以对不同的基因来说，应根据实际情况对PCR条件进行优化。 　　目前石榴F3’H基因序列还没有报道，因而无法获得该基因的特异引物。简并PCR技术利用引物序列的6个简并性碱基，扩增位点多，没有物种特异性，与DNA的复杂程度无关[10]。本研究以GenBank中登录的其他物种的F3’H基因保守区域的核苷酸序列为参考，设计不同的简并引物进行PCR扩增，由于引物的简并性，使得扩增的特异性有所降低，因而必须对使用的引物进行筛选，以获得最佳扩增引物。 　　在PCR扩增过程中，退火温度取决于引物长度、序列、碱基组成和引物的浓度[11]。较高的退火温度会使模板复性的准确性提高，从而提高扩增的特异性，但是温度过高会使得引物与模板亲和力变小，以致不能结合，得不到扩增产物；而温度过低又有可能出现非特异性扩增。另外，由于理论预测与实验差别较大，所以不同的引物适宜的退火温度不同，在PCR扩增时有必要进行最佳退火温度的确定。 　　本研究在对PCR引物进行筛选时，发现F1R2和F2R2这两对引物均能扩增得到目的片段，其中F1R2引物在50 ℃的退火温度下的PCR扩增产物具有特异性，但产量很低，不利于后续实验的进行。而F2R2引物在50 ℃的退火温度下有非特异性扩增产物，通过提高退火温度减少非特异性扩增，取得了较好的扩增效果。实验结果表明，适合石榴花瓣F3’H基因PCR扩增的正反向引物分别为5′-CGTNGAYGTBGTBGTBGCSKCVTC-3′，5′-TCHCCD 　　GCWATGGCCCAHAYRTT-3′，PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；72 ℃保温10 min。 　　参考文献： 　　[1] 苑兆和，尹燕雷，朱丽琴，等.山东石榴品种遗传多样性与亲缘关系的荧光AFLP分析[J]. 园艺学报，2008，35（1）：107-112.