粘质沙雷氏菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因体外表达.docVIP

粘质沙雷氏菌α—乙酰乳酸脱羧酶基因体外表达 　　摘要：根据GenBank中α-乙酰乳酸脱羧酶的基因序列（slaA）设计引物，以粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）HU1基因组DNA为模板通过PCR扩增得到了目标基因，全长为780 bp。将该基因分别连接到大肠杆菌表达载体pET30a和毕赤酵母表达载体pPICZαA上，构建表达质粒pET30a-slaA和pPICZαA-slaA，并在对应的宿主中进行了表达。结果表明，大肠杆菌和毕赤酵母的表达产物的最适温度和pH均分别为40 ℃和7，两者在不同pH下的稳定性也相似，只不过毕赤酵母的表达产物的热稳定性要略强于大肠杆菌的表达产物。 　　关键词：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）；α-乙酰乳酸脱羧酶；体外表达 　　中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）10-2431-04 　　在啤酒工业中，双乙酰含量是衡量啤酒成熟与否的重要指标，该物质主要由合成缬氨酸的中间产物α-乙酰乳酸在酵母细胞外经非酶氧化脱羧而产生。由于过多的双乙酰会带来令人不愉快的馊饭味，工程技术人员会使用相关的手段和工艺降低啤酒中的双乙酰浓度到一定范围内[1]。α-乙酰乳酸脱羧酶能够降低啤酒发酵过程中产生的双乙酰，缩短熟化期，改善啤酒口味，加速啤酒的成熟。但是啤酒酵母菌自身不能产生α-乙酰乳酸脱羧酶[2]，将α-乙酰乳酸脱羧酶基因整合到啤酒酵母染色体中表达是降低啤酒中双乙酰浓度的措施之一[3-6]。外源表达的α-乙酰乳酸脱羧酶已经作为一种成熟的酶制剂产品被直接应用于生产实践中，可以有效地控制啤酒中的双乙酰浓度。目前国内市场上α-乙酰乳酸脱羧酶的品牌产品很多，国外代表有丹麦的诺维信公司（Novozymes）的产品，国内代表有邢台酶制剂厂、广西大学、南宁富谷科技有限公司以及保定满城金星化工有限公司的产品。本研究从粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）克隆到了α-乙酰乳酸脱羧酶基因，并在大肠杆菌和毕赤酵母中进行体外表达，结果表明该酶具有较为乐观的应用前景。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 菌株与质粒 粘质沙雷氏菌HU1、大肠杆菌（Escherichia coli Top10、BL21）、毕赤酵母GS115、质粒pET30a、pPICZαA由湖北大学湖北省工业生物技术重点实验室保存。 　　1.1.2 酶???试剂 限制性内切酶、DNA快速连接试剂盒、高保真PCR聚合酶Primestar等均购自TaKaRa公司，基因组抽提试剂盒、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒购自美国Omega生物技术公司，其他抗生素和化学试剂均为国产分析纯或者进口分析纯。 　　1.1.3 培养基 LB、YPD、MD、BMGY、BMMY见毕赤酵母操作手册。 　　1.2 方法 　　1.2.1 α-乙酰乳酸脱羧酶基因的扩增 根据α-乙酰乳酸脱羧酶基因（slaA）序列选择适当的酶切位点设计引物。PCR反应循环条件为：95 ℃，5 min；95 ℃、30 s，52 ℃、30 s，72 ℃、60 s，30个循环；72 ℃，7 min。 　　1.2.2 序列测定与分析 将纯化后的PCR产物连接到pMD18T载体上，构建测序质粒pMD18T-slaA，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，对转化产物进行双酶切鉴定并送至上海英骏生物技术有限公司测序。 　　1.2.3 α-乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌中的表达及产物鉴定 首先根据测序得到的α-乙酰乳酸脱羧酶基因序列，引入酶切位点Nco I/Hind III设计大肠杆菌表达载体引物。将用该引物扩增得到的PCR产物纯化并双酶切，与经同样的内切酶处理后的载体pET30a连接后转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取转化子并鉴定。将鉴定得到的重组表达质粒pET30a-slaA转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取平板上的单克隆接种于含有卡那霉素的LB培养液中振荡过夜，然后按照体积比1∶50的接种量转接至200 mL的LB培养液中，待培养液吸光度为0.5左右时，于30 ℃用IPTG诱导。用超声波破菌，进行SDS电泳[7]。 　　1.2.4 α-乙酰乳酸脱羧酶基因在毕赤酵母中的表达及产物鉴定 根据α-乙酰乳酸脱羧酶基因设计毕赤酵母表达载体引物，分别引入酶切位点EcoR I/Not I，以粘质沙雷氏菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。将纯化的PCR产物和载体pPICZαA分别用EcoR I和Not I双酶切，然后连接并且转化大肠杆菌Top10感受态细胞，涂布于含25 mg/L Zeocin的低盐LB培养基上。重组质粒经过PCR和酶切验证后进行测序。将读码框正确的重组质粒电转化于毕赤酵母GS115中，转化条件为1.