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实验七 过氧化氢酶米氏常数（Km）的测定 一、实验目的 学习米氏常数（Km）的测定方法。 二、实验原理 过氧化氢酶(CAT)催化下列反应： 2H2O2→2H2O+O2↑ H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知。 2KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4 → 2MnSO4＋K2SO4＋5O2↑＋8H2O 求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度。双倒数作图法求出过氧化氢酶的米氏常数。 三、试剂 1．0.05mol/L草酸钠标准液 将草酸钠（AR）于100～105℃烘12h。冷却后，准确称取0.67g，用水溶解倒入100ml量瓶中，加入浓H2SO4 5ml，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。 2．约0.02ml KMnO4储存液 称取KMnO4 3.4g，溶于1000ml蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。 3．0.004mol/L KMnO4应用液 取0.05mol/L草酸钠标准液20ml，于锥形瓶中，加浓H2SO4 ml，于70℃水浴中用KMnO4贮存液滴定至微红色，根据滴定结果算出KMnO4贮存液的标准浓度，稀释成0.004mol/L，每次稀释都必须重新标定储存液。 4．约0.05mol/L H2O2液 取20%H2O2（AR）40ml于1000.0ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用0.004mol/L KMnO4标定之，稀释至所需浓度。 5．0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）。 四、操作步骤 l．血液稀释 吸取新鲜（或肝素抗凝）血液0.1ml，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2mol/L)稀释至150ml，得1：1500稀释血液。 2．H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为0.05mol/L的H2O2 2.0ml和25%H2SO4 2.0ml，分别用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色。从滴定用去KMnO4ml数，求出H2O2的mol浓度。 3．反应速度的测定：取干燥洁净50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。 依次加入1：1500稀释血液每瓶0.5ml，边加边摇，反应时间5min，按顺序向各瓶加25%H2SO4 2.0ml，边加边摇，使酶促反应立即终止。 最后用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶至微红色，记录KMnO4消耗量(ml)。 五、计算 1.反应速度的计算：以反应消耗的H2O2 mmol数表示。 反应速度=加入的H2O2 mmol数－剩余的H2O2 mmol数 即：H2O2 mol浓度×加入的毫升数－KMnO4 0.004 mol/L×消耗的KMnO4毫升数× 5/2 （式中：5/2为KMnO4与H2O2反应中mol换算系数） 2．求Km值： 下面引用一次实验结果为例，求过氧化氢酶的Km值，供计算参考。 己知KMnO4为0.004mo1/L，标定出H2O2浓度为0.05mol/L，列表计算如下： 六、思考题 l．Km值的意义是什么？ 2．测酶Km值的实验中，需要特别注意哪些操作？ * * 米氏常数的测定：双倒数作图法（Lineweaver-Burk法） 1 Km 1 1 — = —— . — + —— v Vmax [S] Vmax 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 血液稀释液 37度保温5分钟 0.004高锰酸钾 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 25％硫酸 — 1.0 2.0 3.0 4.0 蒸馏水 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 H2O2(约0.05mol/L) 5 4 3 2 1 加入物(ml) 0.068 0.062 0.056 0.043 0.0265 ⑥反应速度V=②一⑤ 0.132 0.098 0.064 0.037 0.0135 ⑤剩余H2O2mmol=④×0.004×5/2 13.20 9.80 6.40 3.70 1.35 ④酶作用后，KMnO4滴定ml 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 ③底物浓度［S］=②÷5 0.20 0.16 0.12 0.08 0.04 ②加人H2O2mmol=①×0.08 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 ①加人H2O2数 5 4 3 2 1 计算程序 按前述方法作图求得Km＝2.5×10-2mol/L。 *