亲和层析-2.pptVIP

3.6 洗脱（elution) 3.6.1专一性洗脱(竞争性洗脱) ?将相同的配体或配体类似物加入缓冲液中； ?浓度0.05~0.1mol/L； 3.6.2 剧烈条件洗脱 ?用盐酸胍、尿素等变性剂配制洗脱液； ?要用适当的方法使蛋白质复性. 3.6.3 非专一性洗脱 1)改变pH: 2)调节盐浓度: 3)添加某些添加剂，有利于洗脱，如：乙二醇、 NaCNS、脲素、盐酸胍等 1)改变pH: ?用弱酸、弱碱调节 ?亲和层析的pH范围为：pH3~12 2)调节盐浓度: ?恒定洗脱（isocratic elution): 适用于样品纯度较高时; ?分步洗脱(step elution ): 用二种以上洗脱缓冲液洗脱; ?梯度洗脱（gradient elution): 用连续的梯度洗脱液洗脱； 3.7 亲和层析柱的再生和清洗 3.7.1 清洗 ?连续用大量洗脱液或高浓度盐溶液彻底清洗层析柱； ?再用平衡缓冲液重新平衡层析柱。 3.7.2 再生 ?亲和层析柱若污染明显,应再生处理; ?可用低浓度的酸、碱、促溶剂3mol/L的NaCNS、变性剂6mol/L脲素、 6mol/L盐酸胍、70%乙醇、表面活性剂等处理； 第四节 提高吸附剂的操作容量 4.1 在配体和基质之间引入”手臂” 4.1.1 原理 对小分子配体,为减少空间位阻,可在基质与配体之间插入若干碳原子“手臂”,将有利于配体与目标物的结合. 4.1.2 制备 ?常用手臂:适当长度的氨基化合物， 如：乙二胺、1,6己二胺、6-氨基己酸等 ?配基偶联后,残留的未反应的“手臂”需进行电荷掩蔽（blocking) 目的：减小非特异性吸附 方法：用醋酸酐掩蔽 4.2 增加配体的取代程度 方法: ?提高活化时的pH,或增加活化时的BrCN的量,可增加配体的取代程度. ?提高配体浓度. 4.3 减少配体与基质之间连接的键 蛋白质、多肽等配体,当它们以最少的共价键与基质偶联时,有利于保持配体的立体结构,保持其生物活性,提高亲和吸附量. 蛋白质与基质偶联时，是以游离氨基（－NH2)与活化的琼脂糖连接的。 4.4 基质多孔性对吸附量的影响 1) 以琼脂糖为基质的亲和吸附剂,制备后,基质多孔性下降小,吸附量稳定; 2)以Bio-gel P为基质的亲和吸附剂,制备后,多孔性下降多,导致吸附量下降. 4.5 影响操作容量的其他因素 ?样品浓度 ?离子强度 ? pH ?流速 第五节 应用 1)纯化抗体,抗原及其结合物 例:用SPA-Sepharose CL-4B 亲和吸附剂 分离IgG、 抗原等 2)纯化糖蛋白 用Lectin-Sephrose 4B 亲和吸附剂, 可分离各种糖蛋白. 3)分离核酸 例:用poly(U)-Sephrose 4B 亲和层析载体, 来分离纯化mRNA 本章小结： 1、原理： 利用生物体内存在的特异性相互作用的分子对而设计的层析方法. 2、操作过程： 1)偶联: 2)装柱—平衡 3)上样吸附:形成M-L-S复合物（静电引力、范德华力、结构互补） 4)缓冲液淋洗,去除杂蛋白; 5)洗脱剂洗脱（改变pH、离子强度） 3、亲和吸附剂的制备： ?溴化氰活化法 ?环氧氯丙烷活化法 两种方法的比较、适用情况 4、亲和层析柱操作过程： 装柱－－平衡－－上样－－淋洗－－洗脱 洗脱方法： ?专一性洗脱－－配体 ?剧烈条件洗脱－－变性剂、表面活性剂等 ?非专一性洗脱－－改变pH、离子强度 5、提高吸附剂的操作容量的方法 ?在配体和基质之间引入”手臂”； ?增加配体的取代程度 ?减少配体与基质之间连接的键 ?注意基质多孔性对吸附量的影响 ?其他操作因素的影响 亲和层析 *