RT-PCR实验标准操作规程.doc

一、实验名称：RT-PCR实验 二、实验目的：对提取的完整RNA进行体外转录，并应用PCR手段进行大量扩增，说明某种基因在体内的表达情况。 三、背景知识：RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。 四、基本原理：RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。 五、药品试剂： 琼脂糖 国产；Ex Taq酶? TaKaRa公司；M-MLV逆转录酶 Amersham公司；? Oligo(dT)18、dNTP?? 上海博亚公司; 引物 上海生工；DNA分子量标准? TaKaRa公司； Tris，EDTA，冰乙酸等 六、仪器设备与材料： ⑴电泳仪???? 北京六一仪器厂??? 型号DYY-12 ；⑵电子天平?? Sartrius公司?? ???型号 BS1103 ；⑶PCR仪? 基因公司? 型号PE 9600；⑷制冰机 上海安亭科学仪器厂?? 型号LQP-B-4；⑸纯水系统?? Millipore公司型号 Biocel；⑹核酸蛋白分析仪?? 贝克曼公司型号 DU650；⑺台式高速冷冻离心机?? 贝克曼公司????? 型号 64R? ；⑻凝胶成像系统? 美国伯乐公司? 型号 GEL DOC 2000 七、实验对象：经抽提得到的完整RNA 八、实验环境：室温15-28℃。 九、操作步骤： 1.50×TAE缓冲液：称取 Tris 242.2 g，先用300 ml水加热搅拌溶解后，加100 ml( 500 mmol/L) EDTA的水溶液（pH 8.0），用冰乙酸调pH至8.0，然后用水定容到1000ml。 2.反转录反应：M-MLV逆转录酶l ul、5×RT缓冲液5 ul 、Oligo(dT)18 (20 umol／L)2 ul、dNTP(20 umol／L)2 ul、RNA 2 ug、补去离子水至20 ul体积，42℃ 1 h逆转录反应，95℃ 5 min灭活M-MLV。 3.PCR反应：在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂, 用手指轻弹混匀，再 加约50 ul石蜡油（有热盖设备的PCR仪可以不加石蜡油）。每个试样3次重复。在台式离心机离心10s后，将PCR管插入PCR仪中。95℃变性5 min；进行35次循环扩增反应（94℃,1 min；退火温度视引物而定（50－60℃）, 1 min；72℃, 1 min ）；然后72℃恒温7 min，取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或在4℃下保存。 表1 PCR反应体系 试剂 终浓度 单样品体积 ddH2O ? 31.25 ul 10×PCR 缓冲液 1× 5 μl 25 mM MgCl2 2.5 mM 5 μl 10 mM dNTPs 0.2 mM 1 μl 10 μM Primer 1 0.5 μM 2.5 μl 10 μM Primer 2 0.5 μM 2.5 ul 5 U/μl Taq 酶 0.025 U/μl 0.25 μl 100 ng/μl DNA 模板 5 ng/μl 2.5 μl 总体积 ? 50 μl 4.PCR产物的电泳检测：将适量的琼脂糖加入1×TAE缓冲液中，加热将其溶解，配制成琼脂糖浓度为2%（w/v）的溶液，然后按每100 mL琼脂糖溶液中加入5 μL溴化乙锭溶液的比例，加入溴化乙锭溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，轻轻垂直向上拔去梳板。在每个泳道中加入适量的PCR产物（需和上样缓冲液混合，10 μL-20μL），其中一个泳道中加入DNA分子量标准，接通电源进行电泳，按2 V/cm 的电压电泳15-30 min。 5.凝胶成像分析（照相）：电泳结束后，取出琼