论文董燕青藤碱对LS刺激的小鼠及RAW264.7细胞A2AP2X7表达的影响.docVIP

青藤碱A2A、P2X7表达的影响 李景，周海松，易浪，董燕*，王培训 （1. 广州中医药大学 临床药理研究所免疫研究室，广州 510405） [摘要] 目的 探讨青藤碱(sinomenine，Sin)对小鼠嘌呤受体A2AP2X7表达的影响。 方法 BALB/c小鼠设空白对照组、模型组、青藤碱组mg/kg、80mg/kg、160mg/kg），青藤碱组给予腹腔注射青藤碱30min，模型组青藤碱组腹腔注射LPS15mg/kg）建立内毒素血症小鼠模型，ELISA法检测小鼠血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）水平RT-PCR检测肝脏、脾脏嘌呤受体A2A，P2X7的表达。细胞设空白组、LPS组青藤碱组青藤碱之后LPS组青藤碱组LPS（100ng/mL），继续培养8h后，上清TNF-α。 结果 血清TNF-αIL-6水平均上升，肝脏、脾脏嘌呤受体A2A、P2X7的表达TNF-α和IL-6水平，并抑制A2A、P2X7表达TNF-α增加，A2A、P2X7表达TNF-α的分泌，并下调P2X7的表达A2A的表达 结论 青藤碱小鼠肝脏、脾脏中嘌呤受体P2X7的表达，A2A表达的影响不同，相关机制有待深入。 [关键词] 青藤碱；嘌呤受体；；细胞因子 青藤碱(sinomenine，Sin)是中药青风藤的主要活性成分，有抗炎、抗风湿、免疫抑制、镇痛、镇静等多种药理作用[]。临床多用其盐酸盐制剂，用于治疗类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)等免疫性疾病疗效较好，副作用小。也有研究报道青藤碱对LPS诱导的肝炎和急性肺损伤动物模型有干预和保护作用[]。 嘌呤受体参与调控机体的免疫应答组织分布广泛，其中又以免疫系统表达最为丰富，发挥重要的免疫调节作用嘌呤受体炎症反应密切相关。青藤碱发挥抗炎作用是否影响嘌呤受体及其内在机制尚不清楚。 1 材料与方法 1.1 实验动物健康SPF级BALB/c小鼠，雄性，体重20±2g，购于广东省动物中心，合格证号：SCXK(粤）2014-0035。1.2 主要药物、试剂与仪器LPS（美国Sigma公司）；HPLC≥97％美国Aladdin公司）盐酸青藤碱（Melonepharma大连美仑生物公司）；ELISA检测试剂盒（Ebioscience产品）；Trizol（Invitrogen产品）；琼脂糖（Biowest Regular AGAROSE G-10，西班牙）；逆转录试剂盒（Invitrogen产品）；PCR试剂盒（Molecular Biology产品）；A2A、P2X7及内参基因β-actin 引物均由生工生物工程公司合成。全自动数码凝胶图像分析系统（Tanon1600，中国上海）；多功能酶标仪（BioTek Synergy HT，美国）；高速冷冻离心机（Eppendorf 5810R，德国）；紫外-可见分光光度计（Beckman Du730，美国）；电泳仪（BIO-RAD，美国）。 1.BALB/c小鼠只，随机分为3组：空白对照组模型组、青藤碱mg/kg组、青藤碱mg/kg组、青藤碱mg/kg组，。模型组一次性腹腔注射LPS（15mg/kg），青藤碱组于注射LPS前30min腹腔注射青藤碱，空白对照组腹腔注射等量PBS。 1.小鼠摘眼球血0.5ml左右，LPS刺激h时各组1～5号采血TNF-α，3h时6～10号采血IL-6，采血后室温静置1h，离心（4℃，900rpm，15min）取上清，ELISA检测。取血后脱颈椎处死小鼠，摘取肝脏、脾脏置于﹣70℃冰箱保存。 1.细胞采用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养，调整细胞浓度为1×105·mL-1，每孔加1mL入24孔板，设空白组、LPS组青藤碱组，每组3个复孔37℃、5% CO2细胞培养箱中培养过后换新的RPMI1640液1mL，青藤碱之后LPS组加LPS 至终浓度100ngmL，空白组加入等体积的PBS继续培养8h收集上清-70℃保存。 1. ELISA检测小鼠血清TNF-α或IL-6 取血清，适当稀释后，按照ELISA检测试剂盒说明书进行TNF-αIL-6的检测。多功能酶标仪检测吸光度。 1. RT-PCR检测嘌呤受体A2A、P2X7 mRNA的表达采用Trizol裂解肝脏、脾脏组织，提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录。RT-PCR中所用的引物由生工生物工程公司合成。P2X7：上游5’-ATTATGGCACCGTCAAGTGG-3’，下游5’-TCAGTAGGACACCAGGCAGA -3’，产物439bp；A2A：上游5’-CCTGCACATCATCAACTGCT-3’，下游5’-TGCTCCTGGGTAAGAAGCTC -3’，产物411bp；β-actin