复方汉防己对肝星状细胞增殖和TTR,ITIH1,SERPINF2表达影响.docVIP

复方汉防己对肝星状细胞增殖和TTR,ITIH1,SERPINF2表达影响 　　[摘要] 目的：观察并比较复方汉防己和干扰素γ对肝星状细胞中转甲状腺素蛋白（transthyretin，TTR）、间-α胰蛋白酶抑制因子家族的重链之一（inter-α inhibitor H1，ITIH1）、α-2抗纤溶酶（serpin peptidase inhibitor clade F member 2，SERPINF2）表达的影响。方法：不同浓度复方汉防己和干扰素γ作用于肝星状细胞（hepatic stellate cell-T6，HSC-T6）48 h，流式细胞仪检测复方汉防己和干扰素γ对HSC增殖的影响，RT-PCR法检测TTR，ITIH1，SERPINF2 mRNA水平的表达，用ELISA检测上清液中TTR，ITIH1，SERPINF2分泌，细胞免疫荧光检测HSC-T6细胞TTR，ITIH1，SERPINF2蛋白定位，Western blotting检测细胞中TTR，ITIH1蛋白的表达。结果：复方汉防己和干扰素γ作用于HSC-T6后，与对照组比较，细胞增殖被明显抑制（P-1组的作用强于干扰素γ组（P 　　[关键词]肝纤维化；肝星状细胞；复方汉防己；转甲状腺素蛋白；α-2抗纤溶酶；间-α胰蛋白酶抑制因子家族的重链之一 　　肝硬化是严重和不可逆的慢性肝脏疾病，而近年来研究发现作为由正常肝脏发展至肝硬化必经过程的肝纤维化却是可逆性病变。临床研究结果提示复方汉防己有较好的抗肝纤维化的作用[1]，细胞培养结果证实，复方汉防己能抑制人胚肺成纤维细胞合成细胞外基质的能力[2]，但其对肝纤维化的关键细胞——肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的生物活性的影响尚无报道。本文通过研究复方汉防己对HSC增殖、相关基因及蛋白表达的影响，观察复方汉防己抗肝纤维化的作用。 　　1材料 　　1.1复方汉防己的制备 自制复方汉防己水提醇沉提取液（汉防己5 g，丹参2.5 g，半枝莲2.5 g，虎杖3.75 g，黄芪5 g等制成水提醇沉提取液，使每毫升含生药2.5 mg），经0.45 μm滤膜过滤除菌，4 ℃保存备用，临用前用含10%胎牛血清的培养液释成不同浓度。 　　1.2细胞系 肝星状细胞株HSC-T6由UCSF肝脏中心实验室Friedman教授惠赠，其表型为活化的HSC。选择对数期生长的大鼠HSC-T6细胞株，胰酶消化后，用含10%胎牛血清的培养液调整细胞浓度为1.2×108个/L，分别加入培养板中，复方汉防己组分4个浓度，每个浓度作3个复孔，置37 ℃，5%CO2和95%O2的细胞培养箱中孵育24 h后，分别加入复方汉防己提取液（MTT法检测复方汉防己提取液抑制HSC-T6的半数抑制浓度为25.49 g·L-1[3]，经过预实验，确定药物浓度），使每组药物浓度（生药）分别为2.5，0.25，0.025，0.002 5 g·L-1，干扰素γ组药物浓度为1×106 U·mg-1[4]，另设空白对照组，再培养48 h，收取细胞并提取上清进行检测。 　　1.3试剂 胎牛血清为Gibco公司产品；DMEM为Hyclone公司产品；Total RNA提取试剂、逆转录试剂盒、荧光染料均为宝生物工程（大连）公司产品；ITIH1，SERPINF2，TTR一抗为SANTA CRUZ公司产品；二抗为北京中杉金桥公司产品；DAPI为碧云天公司产品；ELISA试剂盒为RD分装。 　　1.4仪器 HF240 CO2培养箱（上海力申），TE300倒置显微镜（日本尼康），LC480 PCR扩增仪（瑞士Roche公司），FC500MPL流式细胞仪（贝克曼库尔特），VARIOSKAN FLASH全波长多功能酶标仪（美国Thermo scientific），LSM710激光共聚焦显微镜（德国ZEISS）。 　　2方法 　　2.1流式细胞仪检测复方汉防己和干扰素γ对HSC-T6增殖的影响 胰酶消化，收取各孔细胞，加预冷PBS缓冲液，低速离心去除细胞碎片，加入PI染色液A 1 mL，4 ℃避光染色30 min，然后加入PI染色液B 1 mL，4 ℃避光染色30 min，上机检测。 　　2.2复方汉防己和干扰素γ对TTR，ITIH1，SERPINF2 mRNA水平的影响 ①RNA的提取：用宝生物公司生产的RNAiso Plus提取HSC-T6总RNA，用酶标仪检测提取的RNA浓度，A260/A280在1.8～2.2。②cDNA的合成：用宝生物公司生产的Real-time RT-PCR 20 μL反应体系试剂盒，依次加入5×PrimeScript Buffer 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，Oligo dT P