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第1 细胞培养基本知识技术
4)RPMI1640 RPMI1640是由Moor等人研究成功的,其组分较为简单,适合于许多种类细胞的生长,如肿瘤细胞或正常细胞、原代培养或传代培养的细胞。RPMI1640是目前应用最为广泛的培养基之一。 5)199、109培养基 199培养基是Morgan等人在1950年研制成功的,是最早出现的培养基之一,当时是为培养鸡胚组织而设计。199培养基成分有60多种,几乎含所有氨基酸、维生素、生长激素、核酸衍生物等。109培养基是199培养基的改良之作,比199培养基效果更好。 6)HamF10、HamF12 1962年,Ham针对小鼠二倍体细胞克隆化培养设计了F7培养基,在此基础上进行改良成为F10培养基,使之不仅适合于小鼠二倍体细胞,也适合于人类二倍体细胞的培养。Ham在1963年又研制成出了F12培养基,这种培养基的特点是在配方中加入了一些微量元素和无机离子,可以在加入很少血清的情况下应用,特别适合于进行单细胞分离培养。HamF12培养基也是无血清培养基中常用的基础培养基。 7)McCoy’s5A McCoy’s5A培养基是McCoyT.A等人在1959年研制成功的,是一种专门为肉瘤细胞设计的培养液,后来发现它特别适合于原代细胞培养,适合于较难的细胞的生长。 (3)如何选择培养基 选择培养基并没有一定的标准,有几点建议可供参考: 1)建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。这可以查阅参考文献,或在购买细胞株时咨询。 2)本实验室惯用的培养基不妨一试,许多培养基可以适合于多种细胞。 3)根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选择RPMI1640;进行细胞杂交、基因转移实验,可选择IMDM。 4)用多种培养基培养目的细胞,观察其生长状态,可用生长曲线、集落形成率等指标判断,根据试验结果选择最佳培养基,这是最客观的方法,但比较繁锁。 (4)培养基的配制 配制培养基要注意以下几个问题: 1)认真阅读说明书。说明书中都注明干粉中不包含的成分,常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。这些成分中有些是必须加的,如NaHCO3、谷氨酰胺,有些则要根据实验需要来决定。 2)配制时要保证充分溶解,NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要在培养基完全溶解之后才能添加。 3)配制所用的水应为双蒸水或三蒸水,离子浓度很低,水电阻达30万Ω以上。以三蒸水最佳。 4)所用器皿应十分洁净。 5)配制好的培养基应马上过滤,无菌保存于4℃。 2.无血清培养基 无血清培养基即不需要添加血清就可维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。 无血清培养基的基本配方 无血清培养基分为基础培养液及添加组分两大部分。基础培养液以HamF12和DMEM最为常用,一般两者以1:1混合。添加组分包括以下几大类物质: 1) 促贴壁物质 许多细胞必须贴附于瓶壁才能生长,这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子,一般是细胞外基质,如纤连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子,对许多细胞的繁殖和分化,起着重要的作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁和分化,这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。而层粘蛋白主要促进内皮细胞以及来自内胚层的细胞,如表皮细胞、支气管上皮细胞、分泌型上皮细胞、神经细胞和肝细胞等。 2) 促生长因子及激素 针对不同的细胞添加不同的生长因子,如培养角质细胞加表皮生长因子(EGF),培养神经细胞加神经生长因子(NGF),培养内皮细胞加内皮细胞生长因子(ECGF)等。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质。有些激素对于许多细胞是必不可少的,如胰岛素。还有一些激素对特定的细胞有重要的作用,如泌乳素对乳腺上皮细胞。 3)酶抑制剂 培养贴壁生长的细胞,需要用胰酶消化传代,在无血清培养基中必须含有酶抑制剂,以终止胰酶的消化作用,达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制剂。 4)结合蛋白和转运蛋白 常见的有转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加量比较大,可增加培养基的粘度,保护细胞免受机械损伤。许多用于旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。 5)微量元素 硒是最常见的 以下是一种无血清培养基的基本配方:DMEM:F12=1:1(V/V),转铁蛋白5μg/m1,纤粘蛋白1μg/ml,胰岛素5μg/m1,硒30mM,牛血清白蛋白Img/ml,EGF25ng/ml,大豆胰酶抑制剂1~5mg/ml。 3. 无蛋白培养基(protein free medium,PFM)和限定化学成分培养基(chemica
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