猪诱导多能干细胞ips及其化发育研究.doc

一、研究内容 拟解决的关键科学问题 探讨猪iPS重编程机制，利用猪动物模型全面评估iPS的安全性、有效性是本项目拟解决的关键问题。 iPS在小鼠和人上的成功获取，将干细胞领域的研究带到了一个崭新的时代，为生命科学的未来发展带来了新的曙光。然而，iPS仍存在很多的不确定安全隐患，有效性也有待证实，在小鼠、人之外的其它物种上尚没有报道，仍处于发展的起步阶段，还不能直接造福于人类归根结底是人们对其科学基础细胞的重编程过程及其机制缺乏系统深入的了解。我国人口增长压力大、出生缺陷多、老龄化加剧，人们对优质畜产品日益增长的需求和畜牧业发展滞后、家畜良种偏少、地方物种遗传资源流失严重之间的矛盾日益突出，是我国贯彻可持续发展、全面建设和谐社会所面临的严峻挑战。解决这些国家重大需求问题，必然要求我们对以iPS、ES代表的多能性干细胞技术进行深入研究。 基于iPS、ES等多能性干细胞在研究人正常胚胎发生、非正常发育、发现合成药物和胚胎缺陷检测及细胞置换、器官移植和基因治疗，优质家畜品种培育、濒危动物保护等方面具有重要的参考、应用价值。本研究拟利用猪这一模型，重点解决如下问题： 猪重编程的关键基因 通过筛选能诱导出猪iPS的转录因子组合以及直接利用现有在小鼠和人iPS上成功的诱导因子组合，进而得到猪iPS系。而后再对猪iPS系与常规自然胚来源的猪ES系在多方面进行比较，经过诱导终末分化体细胞产生的猪iPS究竟和ES之间在获取效率，细胞形态、增殖特点、细胞表面特异性标志物、基因表达及表观遗传学状态上有多大相似和差异，对于深入认识去分化/分化机制很有帮助； 2 猪iPS系系能力 能否成功参与嵌合体各类型细胞的发生，尤其是能否参与形成系细胞，是衡量多能性干细胞发育能力的一个重要标准。因此，本项目拟将诱导获取的猪iPS和常规ES注入到正常2倍体或4倍体囊胚腔内，检测、分析iPS是否参与嵌合体各类细胞，尤其是种系生殖细胞的形成；多能性干细胞发育能力的办法，嵌合体发育对认识iPS的多能性、评估iPS安全性等十分关键，也对人类iPS具有十分重要的参考价值。 3 iPS提高克隆胚的发育 已有研究表明，多能性干细胞做供核时，克隆效率高、后代存活率高、畸形率低。以iPS为供核开展克隆，尝试进行转基因、基因组修饰克隆猪制备，以培育生长性能好、环境友好型、品质优良的家猪新品种，人类心血管疾病模型及为人类异种器官移植提供供体。因此，此项研究将不仅有助于提高克隆效率，制备转基因猪，还会有助于我们更直接了解iPS的安全性，为家畜良种培育及人类再生医学提供重要参考依据。 4 猪iPS的分子机制 分化的体细胞可以通过体细胞克隆、与胚胎干细胞融合、卵母细胞提取物共培养等方法发生不同程度的去分化，其间最主要的重编程事件有端粒的恢复以及表观遗传学重编程（如DNA甲基化、X-染色体失活、组蛋白修饰、染色质重塑等）。研究表明，重编程错误或者不彻底，会直接影响体细胞能否彻底恢复发育全能性，上述技术的推广应用。因此，作为最新被建立起来能使分化的体细胞发生去分化的手段，iPS在形成过程中的重编程事件，如端粒和表观遗传学修饰的重编程是否正常，也将直接影响iPS全能性是否完全恢复。了解这些事件，不仅能丰富我们对细胞分化/去分化机制的认识，也将能促进我们对人iPS安全性、可靠性和应用的研究。 主要研究内容 围绕着解决上述关键科学问题，重点解决猪iPS系诱导关键因子组合筛选、诱导策略、诱导后发育潜能检测分析；比较猪iPS系与ES系之间生物学特性的异同，深入比较体细胞核移植与iPS这两种细胞重编程的效率；尝试利用猪iPS、ES这些多能性干细胞提高核移植效率，制备普通的、转基因或者基因组修饰的克隆猪（如人类心血管疾病模型、异种器官移植器官供体猪等），探索已分化体细胞端粒和表观遗传重编程致去分化的规律及作用机制。因此，本项目拟课题组已备的基因克隆与分析平台、干细胞分离建系平台、嵌合体制备与分析平台、转基因和基因组修饰技术平台、细胞核移植（克隆）平台、细胞重编程事件检测分析平台，重点研究：1）猪iPS系诱导关键基因筛选和技术体系建立；2）猪iPS体内、体外的分化发育潜能及猪iPS的应用；3）猪iPS在形成期间的重编程的规律与机制。 猪多能性干细胞特异因子的分子生物学研究 比较猪体细胞与早期胚胎、成体干细胞基因表达差异，获得猪干细胞特异因子； 克隆猪多能性干细胞特异因子的编码基因； 构建猪干细胞特异因子逆转录病毒载体； 构建猪干细胞特异因子mRNA体外转录载体。 猪iPS系的构建 猪iPS关键基因组合研究：已知小鼠和人类成纤维细胞上获得成功的诱导基因组合是：ct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4; Oct3/4 Sox2,Nanog, Lin28; Oct3/4, Sox2, Klf4三种组合