慢病毒包装、浓缩纯化、滴度实验步骤.docxVIP

一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。所以要在细胞购进时就进行冻存。2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。3. 倒去细胞上清液，加入D-Hanks液洗去残留的培养基。4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。6. 细胞计数。7.将细胞离心，1000rpm，2min。8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。2. 消化细胞，方法同上。3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。密度为3×105个/ml。4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。4. 将1ml细胞