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康腹止泻片微生物限度检查法 【摘要】 目的 建立康腹止泻片微生物限度检查法。 方法 采用培养基稀释法。 结果 该法能有效消除康腹止泻片在检验条件下对细菌、真菌及酵母菌的抑制作用;控制菌可用常规法检查。结论 该法简单、快捷，可用于康腹止泻片的微生物限度检查，有效控制其质量。? 【关键词】 康腹止泻片;微生物限度检查;培养基稀释法 康腹止泻片是由木馏油、老鹳草粉、黄柏干浸膏等药材经加工而成的中成药片剂。本品味特异，具有化滞止泻功效。用于饮食不节或水土不服导致的食欲不振、恶心呕吐、腹胀腹泻、消化不良等症。处方中的老鹳草、黄柏具有一定的抑菌作用[1，2]，若用常规法对其进行微生物限度检查，结果将不能真实反映样品的污染情况[3]。为此，根据《中国药典》2010年版的有关规定[4]，对康腹止泻片微生物限度检查方法进行验证，以确定其是否适用于本品的微生物限度检查，从而准确有效地检出样品中污染的微生物[5]。验证表明，采用培养基稀释法对本品进行检查，可使污染的微生物能被顺利检出，常规法则可用于控制菌的检查。该方法简便、快捷、准确、可行，能有效控制康腹止泻片的质量，并可为同类药品的微生物限度检查法提供科学的实验依据。 　　1 仪器与试药 　　1.1 菌种 　　金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)10123]，均购自中国药品生物制品检定所;黑曲霉(ATCC16404)购自广东省微生物研究所。 　　1.2 培养基 　　营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、胆盐乳糖培养基。 　　1.3 供试品 　　康腹止泻片(批号41EA1)，大幸药品株式会社。 　　2 方法与结果 　　2.1 菌液的制备[4] 　　2.1.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌 　　取新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，培养18～24 h;培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液。用于控制菌验证时制成每1 mL含菌数为100 cfu的菌悬液。 　　2.1.2 白色念珠菌 取新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，培养24～48 h;培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为50～l00 cfu的菌悬液。 　　2.1.3 黑曲霉 取新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7 d，加入0.9%无菌氯化钠溶液3～5 mL，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出胞子悬液至无菌试管内，用0.05%(体积分数)聚山梨醇的0.9%(体积分数)无菌氯化钠溶液制成每l mL含孢子数50～100 cfu的孢子悬液。 2.1.4金黄葡萄球菌检测 金黄色葡萄球菌—为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽孢，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。 该菌是葡萄球菌中对人类致病力最强的一种，能引起人体局部化脓性病灶，严重时可导致败血症。 3、血琼脂培养基： 成分：营养琼脂 100ml 脱纤维羊血（或兔血） 10ml 制法：将营养琼脂加热融化，待冷至50℃左右无菌操作加入脱纤维羊血（或兔血）摇匀，制成平板，置冰箱内备用。 4、菌落特征： 血琼脂平板：菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。 Baird-Parker平板：菌落呈圆形，光滑，凸起，湿润，直径为2—3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围一混浊带，在其外层有一透明带。 5、镜检：为革兰氏阳性菌，排列呈葡萄状，无芽孢，无荚膜，致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为0.5um—1um。 2.2 供试液的制备 　　取样品10 g，加入pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液至100 mL，用匀浆仪打碎，摇匀，制成1∶10的供试液。 　　2.3 验证试验 　　验证实验所用培养基均按《中国药典》2010年版附录“微生物限度检查法”要求，进行培养基适用性检查，且均符合规定。 　　2.3.1 细菌、真菌及酵母菌计数(平皿法培养基稀释法) 在确定适合的检查方法后，验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 　　试验组:各取1∶10供试液1、0.5、0.2 mL和试验菌液1 mL，分别注入平皿中，立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。 　　菌液组:取试验菌液1 mL注入平皿中，立即倾注相应琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，测定所加的试验菌数。 　　供试品对照组:各取1∶10供试液1、0.5、0.2 mL，按试验组操作，不加菌液，测定样品本底菌。 　　计算各试验菌株的回收率，结果见表1。表