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绿原酸对Aβ引起小脑颗粒细胞损伤保护作用 　　【摘 要】目的：探讨绿原酸对淀粉样β蛋白（amyloid beta-protein，Aβ）引起的小脑颗粒细胞损伤的保护作用。方法：体外培养小脑颗粒细胞和腹腔巨噬细胞，将经过10μmol/L Aβ预处理48h的巨噬细胞上清液移入神经细胞中，同时加200μmol/L的绿原酸。培养2天后，采用MTT法、western bolt和乳酸脱氢酶检测试剂盒检测细胞活性、微管相关蛋白-2（microtubule- associated protein-2，MAP-2）表达水平和乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）漏出量。结果： 将Aβ预处理的巨噬细胞上清液移入到单独培养的小脑颗粒细胞48h后，可使小脑颗粒细胞活性明显降低，仅为正常的28.35%，加入绿原酸后，细胞活性明显增加达到正常的75.82%（P 　　【中图分类号】R85 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）11—0008—02 　　引言 　　阿尔茨海默病是一种中枢神经系统退行性疾病，最显著的病理学特征是在神经细胞之间出现大量与神经元退行性病变有关的老年斑、神经原纤维缠结和明显的胶质细胞化[1-2]。已有大量相关的实验资料表明Aβ触发了由小胶质细胞参与的炎症反应，使其释放炎性细胞因子，进而导致神经元的丢失和认知功能的下降。绿原酸具有抗炎作用，但对Aβ所致的炎症反应是否具有抑制作用报道较少[3]。因此，本实验拟通过检测绿原酸对经Aβ预处理的巨噬细胞上清液加入培养的小脑颗粒细胞中，细胞的活性、MAP-2和LDH漏出量的影响，以探讨绿原酸对Aβ引起神经细胞损伤的保护作用。 　　1 材料和方法： 　　1.1大乳鼠神经细胞培养：出生两三天的SD大鼠乳鼠，无菌条件下取出小脑，置于培养基中，剔除软脑膜和血管。剪成约1mm3小块，加入0.25%的胰酶溶液，消化30min，洗涤3次，制成细胞悬液，调整细胞浓度为106，接种于0.1mg/mL多聚赖氨酸处理过夜的盖玻片的24孔培养板中。置于37℃孵箱中培养，后换液，加入含终浓度阿糖胞苷的培养基继续培养以抑制非神经细胞增殖，以后每2天换液1次，第7天开始实验。 　　1.2小鼠腹腔巨噬细胞培养：小鼠腹腔注射淀粉肉汤0.5mL，7d 后取腹腔巨噬细胞（锥虫蓝吞噬实验显示99%为巨噬细胞），单独培养接种浓度为106/ml置于37℃孵箱孵箱中培养。接种24h后??向培养基中加入经老化处理的Aβ 至终浓度为10μmol/L，继续培养48h后收集上清。 　　1.3细胞分组及处理方法：神经细胞随机分为4组，①正常培养的神经细胞，②正常培养的神经细胞+巨噬细胞上清液；③正常培养的神经细胞+巨噬细胞上清液+200μmol/L的绿原酸；④正常培养的神经细胞+10μmol/L Aβ。 　　1.4 MTT检测细胞活性 在细胞培养48小时后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS （ph=7.4）配）20ul。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150ul DMSO，振荡10 分钟，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，计算活细胞数。 　　1.5 微管相关蛋白-2表达水平 培养2天后，观察细胞形态并拍照，收集细胞106，提取细胞总蛋白，应用western blot 方法检测微管相关蛋白-2的表达。 　　1.6 乳酸脱氢酶漏出量 留取培养的上清液，在pH值为10时乳酸基质在氧化型辅酶I存在的情况下，经乳酸脱氢酶催化反应生成丙酮酸，后者与2，4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在波长为440nm下比色测定丙酮酸二硝基苯腙含量，推算出乳酸脱氢酶漏出量（具体操作按照试剂盒说明进行）。 　　1.7 统计分析：实验结果以 ，应用SPSS13.5分析。 　　2 结果 　　2.1 细胞活性的检测 在细胞处理48h后，应用MTT检测与正常培养的神经细胞相比，正常培养的神经细胞+巨噬细胞上清液组细胞的活性明显下降，仅为正常培养神经细胞的28.35%；说明神经细胞在巨噬细胞培养上清（经Aβ活化后）的作用下引起细胞的大量死亡。而在正常培养的神经细胞+巨噬细胞上清液+200μmol/L的绿原酸组，细胞活性为正常培养神经细胞的75.82%，说明在加入绿原酸后，能明显减少神经细胞的死亡起到保护神经细胞的作用。在正常培养的神经细胞+10μmol/L Aβ组，神经细胞的活性为正常培养细胞的91.27%，说明在正常培养的神经细胞中，虽然经过了纯化处理，但仍存在一定的胶质细胞，在Aβ活化后，引起一定神经细胞死亡。 　　2.2 微管相关蛋白-2表达 在细胞处理48h后，收集细胞，应用western blot 检测，从结果可见，在正常