量子点为载体转染survivinsiRNA至人舌鳞癌Tca8113细胞研究.docVIP

量子点为载体转染survivinsiRNA至人舌鳞癌Tca8113细胞研究 　　[摘要] 目的 靶向survivin 基因的siRNA通过量子点为载体转染至人舌鳞癌Tca8113细胞中，研究其对survivin 基因表达的影响，为量子点在肿瘤的基因治疗方面提供实验依据。 方法 Survivin siRNA通过量子点转染至人舌鳞癌Tca8113细胞中，同时设立LIPOFECTTAMINE 2000脂质体为转染载体的对照组以及未转染的空白组，采用实时定量 RT-PCR检测各组Tca8113细胞中survivin mRNA表达的改变情况。结果 实验组用50 pmolQD转染100 pmol survivin siRNA入Tca8113细胞48 h后，检测到survivin siRNA mRNA表达量相对于空白组下降64%，QD与siRNA的使用比例为1∶2；对照组中用100 pmol lipofectamine2000脂质体转染100 pmol survivin siRNA入Tca8113细胞48h后，检测到survivin siRNA mRNA表达量相对于空白组下降90%，QD与siRNA的使用比例为1∶1。结论 量子点为载体转染survivin siRNA能够有效的抑制Tca8113细胞survivin mRNA的表达，量子点有望作为RNA干扰技术的新型载体。 　　[关键词] 量子点；舌鳞癌Tca8113细胞；siRNA 　　[中图分类号] R19 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2013）08（b）-0001-04 　　人类肿瘤的发生、发展大多是由于基因的改变致细胞凋亡的异常引起的。人体常见的口腔肿瘤细胞中，survivin基因的水平一般都会升高，它会抑制细胞凋亡。细胞凋亡与增殖一样，是一个高度可调节性的生物化学过程。RNA干扰（RNA interference，RNAi）成为目前的热点研究之一，它是多种生物体内由双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）分子介导的基因阻抑现象，通过导入外源或内源的dsRNA，细胞内加工后产生siRNA（小分子干扰RNA片段）可以特异性阻滞基因的表达，使内源性mRNA 发生特异性降解，从而引起转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）。 　　量子点（quantum dot，QD）是一种直径在1～100nm的半导体纳米颗粒，而粒径在2～10nm的量子点可通过内吞作用进入细胞。QD具有特殊的光学特性，单一种类的QD能按照尺寸变化产生发光波长不同、颜色分明的荧光，并且这种荧光的强度和稳定性都大大优于有机荧光染料，可以让研究人员更长时间地观察细胞或组织；此外，QD具有良好的生物相容性，对细胞的毒性低。2010年1月―2012年9月在该研究中，利用量子点作为非病毒的基因转染载体，对口腔鳞癌Tca8113细胞中高表达的凋亡抑制基因Survivin的siRNA进行修饰并转染至人舌鳞癌Tca8113细胞中，达到有效抑制survivin 基因的表达至肿瘤细胞凋亡的目的。以期望对口腔鳞癌细胞中高表达的凋亡抑制基因Survivin基因沉默提供理论和实践依据，探索出一种安全，低毒，高效并可进行动态观测的siRNA转运载体。 　　1 材料 　　1.1 转染所需设备试剂 　　（1）人舌鳞癌Tca8113细胞 　　（2）Survivin siRNA：20nmol冻干粉 　　（3）量子点（QD605）：表面带正电荷的水溶性量子点，4 mol/L 　　（4） LIPOFECTAMINE 2000脂质体 　　（5） OPTI-MEM I 培养基 　　（6） 荧光显微镜：OLYMPUS，IX51 　　1.2 实时定量RT-PCR所需主要试剂及设备 　　1.2.1 主要试剂 ①Trizol RNA提取试剂；②氯仿；③异丙醇；④无水乙醇；⑤SYBR Green PCR Master Mix；⑥焦碳酸二乙酯（DEPC）；⑦TBE电泳缓冲液：Tris碱54 g，硼酸27.5 g，0.5 mol/EDTA（PH：8.0）20 mL，加双蒸水600 mL，剧烈搅拌至溶解，加水至1000 mL定溶，即为5×TBE，用时加双蒸水稀释成0.5×TBE；⑧核酸染料。 　　1.2.2 主要设备 ①高速冷离心机：Heraeus，Megafuge 1.0 R；②定量PCR仪：ABI PRISM 7500*Sequence Detection System；③电热恒温鼓风干燥箱：Heraeus，UT6；④Eppendof管、Tip头等均用0.1%的DEPC水浸泡过夜，用无菌蒸馏水冲洗后，高压灭活DEPC活性，37℃烤箱烘干备用