兔软骨细胞的分离.docxVIP

目的　探讨兔软骨细胞培养方法。方法　采用胶原酶Ⅱ分段消化法从4周龄新西兰兔的关节软骨中分离出软骨细胞并进行原代和传代培养。每日在倒置显微镜下观察细胞形态及其生长情况。并用甲苯胺蓝异染色进行细胞表型鉴定。结果　软骨细胞形成单层的时间原代培养1周左右,传代培养约4~5天,细胞以圆形或上皮样细胞形态为主。甲苯胺蓝染色证实细胞可合成蛋白多糖,异染反应主要集中在细胞集落样生长区,异染程度以原代培养最为显著。结论　采用本方法培养兔软骨细胞是可行的。软骨细胞是关节软骨破坏过程中的靶细胞,研究靶细胞的变化是探索关节软骨破坏、病理和治疗的重要方法,本实验的目的是建立体外软骨细胞培养体系,为进一步实验创造条件。1　材料与方法1·1　培养用液及主要试剂: 无水乙醇PBS液胎牛血清DMEM培养液0·25%胰蛋白酶0·2%Ⅱ型胶原酶10%中性福尔马林缓冲液4%台盼蓝母液0·04%甲苯胺蓝染色液碘酊酒精生理盐水70%乙醇固定1·2　主要仪器与材料:剪刀 1无菌平皿 1手套 1+1烧杯1+1+1CO2培养箱超净工作台倒置显微镜水浴恒温振荡器恒温磁力搅拌器高速冷冻离心机眼科小剪刀 1无菌离心管1+1培养瓶3+培养板血球计数板计数1骨剪 1尖刀片 1小刮匙 1悬液吸管1+1120目尼龙网筛1+1小锥形瓶 11·3　动物: 4周龄健康新西兰兔。1·4　软骨细胞的分离和培养1·4·1　软骨细胞的分离步骤:一只健康4周龄新西兰兔脱颈处死,备皮,用碘酊酒精背部皮肤消毒,无菌操作沿背部中线剪开并剥离皮肤,更换手术器械及手套,以防碘酊等有机物污染。 (30min)游离并用骨剪截取膝关节,置入无菌平皿,带入超净工作台在超净工作台作如下操作:先用双抗的pbs充分漂洗,直到没有碘伏的颜色(5min),离断髌韧带,内外侧副韧带以及前后交叉韧带,切开膝关节,刮除关节周围附着的组织如肌肉、脂肪、骨膜、滑膜, pbs液充分漂洗。用尖刀片充分利用软骨的弹性,削下每个关节表面的软骨,不要误带软骨下骨和骨膜,一般以不渗血为度。充分漂洗软骨小块,更换洗液3次(pbs液)。用眼科小剪刀剪碎至1 mm3大小,用小刮匙把软骨小块转移至小锥形瓶中。加入0·2%Ⅱ型胶原酶5 ml,置磁力搅拌器上37℃消化45 min,将游离出的带有酶溶液的软骨细胞用悬液吸管吸出, 120目尼龙网筛过滤。所得滤液放入一无菌离心管内, 1200 r/min离心8 min,弃上清,加入5 ml含有血清的DMEM培养液混匀以终止消化。1200 r/min离心5 min,弃去上清液,只留下细胞球,并加入少量含有血清的培养液吸打后先封口置放。原消化瓶中再加入0·2%Ⅱ型胶原酶5 ml,如前法消化45 min,消化后的处理同上。然后把2次消化所得的软骨细胞悬液合并在一起,台盼蓝染色检查死亡细胞比例,血球计数板计数, 并把细胞悬液稀释成(2~3)×105细胞/ml,接种于培养瓶中。1·4·2　原代培养:将消化所得的细胞悬液以(2~3)×105细胞/ml接种于25 cm2培养瓶中,共接种3瓶,每瓶加5 ml的细胞悬液。把培养瓶置于CO2培养箱中培养(温度37℃,饱和湿度, 5%CO2, 95%空气)。48 h后视细胞贴壁情况更换培养液,以后每两天更换培养液1次。1·4·3　传代培养:当倒置显微镜观察软骨细胞汇合成片,长满大部分培养瓶壁后,倾去培养液,加入0·25%胰蛋白酶2 ml,室温下静置5~10 min,在倒置显微镜下若观察到细胞重新变成圆形,个别细胞开始浮游,此时应迅速而轻柔地弃去胰蛋白酶溶液而不使瓶底细胞随胰蛋白酶溶液流失。重新加入新培养液,吹打细胞使其散开形成软骨细胞悬液,按前述方法分瓶培养或冻存以备用。1·4·4　软骨细胞的组织化学染色鉴定:倾去培养瓶中的培养液后用生理盐水漂洗,置入10%中性福尔马林中固定过夜。70%乙醇固定20 min以除去四价铵离子,以免阻碍染色。用0·04%甲苯胺蓝染色20 min,迅速用无水乙醇漂洗1次,空气干燥,倒置显微镜下观察摄影。2　结　果2·1　倒置显微镜观察:分离培养的原代软骨细胞呈圆球形,台盼蓝排斥试验示活细胞率约90%左右。悬浮12 h逐渐开始贴壁, 24 h后大部分贴壁,首先细胞伸出短小的生长突,呈扇形;扇形生长突不断扩大,细胞的两侧或三边都可伸出生长突。此时细胞在倒置显微镜下呈片状贴附,形态呈梭形、或三角形、或多角形,胞浆内可见折光的颗粒,周围有细长的突起,胞核明显呈圆形或椭圆形,核仁清晰,原代培养的软骨细胞7天即可长满瓶壁,部分区域呈多层生长。在集落生长区和多层生长区细胞被分泌的基质所包埋,形成肉眼可见的结节样组织。传代培养的软骨细胞一般24 h即可完全贴壁,细胞伸出伪足,充分铺展。传一代的软骨细胞5天左右即可形成单层,细胞仍以圆类、类上皮细胞样外观为主。随着传代次数的增加,细胞