姜黄素诱导结肠癌LoVo细胞凋亡作用及机制研究.docVIP

姜黄素诱导结肠癌LoVo细胞凋亡作用及机制研究 　　[摘要] 目的：探讨姜黄素促人结肠癌LoVo细胞凋亡的生物学作用及其调控机制。方法：体外培养人结肠癌LoVo细胞，0～20 mg·L-1不同浓度姜黄素处理后，采用MTT 比色法测定姜黄素对细胞的增殖抑制作用，利用透射电镜观察细胞的超微结构，采用PI单标流式细胞仪测定细胞周期分布，Annexin V-FITC/PI双标法检测细胞凋亡率； 采用 RT-PCR检测Bax，Bcl-2，Caspase-3，Bcl-xL mRNA表达水平。结果：MTT检测显示姜黄素能显著抑制人结肠癌LoVo细胞的生长、増殖，呈现浓度和时间效应关系；透射电镜结果显示姜黄素能使LoVo细胞发生形态学改变，呈现典型凋亡细胞特征；流式细胞仪分析显示姜黄素能阻滞细胞周期于S期，诱导细胞发生凋亡。RT-PCR检测显示姜黄素可促进细胞中Bax，Caspase-3 mRNA 表达，抑制Bcl-2，Bcl-xL mRNA 表达。结论： 姜黄素能显著抑制人结肠癌LoVo细胞的增殖并促进其凋亡，这种生物学效应可能与激活Bax表达、抑制Bcl-2和Bcl-xL表达而活化Caspase-3的信号通路有关。 　　[关键词] 姜黄素；结肠癌；LoVo；细胞凋亡 　　结肠癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤。随着人们生活习惯和饮食结构的改变，我国结肠癌的发病率呈逐年上升趋势。除了传统的手术、放疗与化疗外，由于天然药物的多成分、多靶点、多环节、多途径效应，使人们认识到“回归大自然”的重要性，植物源化合物的抗肿瘤研究已逐步成为临床抗肿瘤药物研究的热点。 　　姜黄素是从草本植物姜黄的根茎中提取的一种天然多酚，为姜黄的主要活性成分。在亚洲一些国家，姜黄素一直被广泛地用作治疗炎症、哮喘、肝功能紊乱等疾病的药物、食品着色剂和调味剂。此外，姜黄素还在许多肿瘤细胞中发挥着抗炎，抗氧化，抗肿瘤和化学预防作用[1-2]。许多体内外实验也证实姜黄素能抑制肿瘤生长，显著减少瘤体的数目，减轻多种致癌因素对机体的损害[3-5]。由于姜黄素的药理作用十分广泛，其抗癌作用机制较为复杂，目前仍未完全阐明。本研究拟探讨姜黄素对结肠癌细胞株LoVo的增殖抑制和凋亡诱导作用机制，为进一步阐明姜黄素的抗肿瘤机制提供更多的实验依据。 　　1 材料 　　1.1 药物及试剂 姜黄素（C1386-10 g，Sigma公司进口分装，临用时以少量DMSO溶解，再加培养液稀释至所需浓度，其中DMSO的终浓度TMMultisource 总RNA小量制备试剂盒（美国Axygen Biosciences公司，批号AP-MMN-MS-RNA-50）；逆转录试剂盒 （北京BioTeke公司，批号PR6901）。 　　1.2 仪器及设备 Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；CO2培养箱（美国Thermo公司）；IX51倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；5331梯度PCR仪（德国Eppendorf公司）；Epics- XL II流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）；MS-1型旋涡混合器（德国IKA公司）；MK3酶联免疫检测仪（美国Thermo公司）；H-7500透射电镜（日本日立公司）；超薄切片机（德国莱卡公司）；MIKRO22R 1110型高速冷冻离心机（德国Zentrifugen公司）；ND-2000超微量核酸蛋白检测仪（美国Thermo公司）；DYY-6C电泳仪（北京市六一仪器厂）；AlphaImager HP 荧光/可见光凝胶成像分析系统（上海培清科技有限公司）。 　　1.3 细胞株及细胞培养 人结肠腺癌细胞株LoVo，由广州军区广州总医院医学实验科惠赠，培养于含10% FBS的RPMI 1640培养液中，置于37 ℃，5% CO2，饱和湿度条件下培养。每2～3 d更换培养液1次，待细胞生长融合率达到80%左右时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2进行传代培养。全部实验均选用对数生长期状态良好的细胞。 　　2 方法 　　2.1 细胞增殖抑制试验 取处于对数生长期，状态良好的LoVo细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，调整细胞浓度为5×104个/mL，接种于96孔培养板，200 μL/孔。培养24 h细胞完全贴壁后，将培养液更换为含不同浓度姜黄素的培养液，姜黄素质量浓度依次为20， 10， 5， 2.5， 0 mg·L-1，每个浓度接种6个复孔，为实验组（T）；另设置不加姜黄素的3个孔为阴性对照组（C，只加入等量的培养液）和不加培养液的3个孔为空白对照组（B，只加入等量的PBS）。加药完毕后，置37 ℃，5% CO2，饱和湿度条件下继续孵育培养24，48，72 h。待培养结束后，每孔加入5 g·L-1 MTT 20 μL，37