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Aurora―B激酶抑制药筛选和抗肿瘤活性研究 　　摘 要：目的：分析探讨Aurora-B激酶抑制药的筛选和抗肿瘤活性研究。方法：先对Aurora-B激酶抑制药做筛选，主要是在野生型酵母菌Y300和ipll-321温度敏感型突变株酵母菌这些模式菌中做筛选。并运用一系列实验和检测方法来对抗肿瘤活性做研究。结果：经过筛选之后，得到了5个微生物发酵液、12个化合物，对于重组纯化的人Aurora-B激酶的活性抑制率高于百分之五十有7个化合物，在这7个化合物中有3个化合物的活性较好。结论：野生型酵母菌Y300和ipll-321温度敏感型突变株酵母菌为高通量的筛选模型，能够完成多个新的具有抗肿瘤活性的Aurora-B激酶抑制药。 　　关键词：Aurora-B激酶抑制药的筛选；抗肿瘤活性研究 　　对于人类这种高等哺乳动物而言，其由Aurora家族成员参与中心体成熟、中心体分离、核膜破裂等等过程，而对于Aurora激酶家族而言，则分为三大类家族成员，分别为Aurora-A、Aurora-B、Aurora-C。据相关学者研究表明[1]，如果在人体内多种肿瘤中出现了Aurora激酶家族成员的过表达[1]，可以说明这些激酶成和肿瘤的发生原因有可能存在很大程度上的关联，并且对肿瘤的发展也有相关的影响。因此，本文通过高通量筛选Aurora-B激酶抑制药，做出了对肿瘤活性的研究。 　　一、材料和方法 　　1.材料所需 　　材料需要相关仪器和试剂，仪器主要运用细胞培养箱和荧光多功能分析仪。试剂则有胎牛血清、胰蛋白酶、RPMI1640培养基和DMEM培养基，以及酵母细胞的需要。 　　2.Aurora-B激酶抑制药的筛选 　　在筛选的过程中，首先要将酵母细胞进行接种，1）将其接种到YPD液体培养基中，培养的室温要保持在25℃左右，运用摇瓶培养的模式进行培养，其模式按照150r?min-1进行。其次将对数生长期的菌液进行稀释，稀释的比例按照1：100来进行，并且把稀释后的菌液放入96孔板内，每一个孔的菌液为2μl，使个化合物的最终浓度保持在10μg?ml-1，然后实行阴性对照，且同时实行百分之一DMSO对照，在孔板培养中的温度要保持在25℃，并且培养24小时。对于Y300和YYW64两类菌株的判断，如果Y300菌株并没有进行生长，但YYW64菌株在生长，这种情况可以判断为阳性，然后再对候选化合物???行稀释，稀释遵从梯度稀释的原则。从而完成对最小抑制浓度的测定。2）第二进行微生物发酵液的筛选，仍将对数生长期的菌液进行稀释，稀释的比例按照1：100来进行，把稀释后的菌液加入到溶解晾凉至37℃以下的YPD固体培养基中，然后再把这些菌液倾倒在封好的玻璃板上，将其放置自行凝固，凝固以后再放置灭菌纸片，在这些纸片中，对于每一个纸片都要加入200μl的新鲜发酵液，并且保持室温在25℃，培养24个小时，在培养的过程中做观察监测，观察菌株的生长状况，对抑菌圈大小进行测定，如果Y300和YYW64两类酵母菌株之间抑菌圈大小差别在1.5倍之上，那么可以判断为阳性。 　　3.化合物对重组纯化的人Aurora-B激酶的体外抑制作用 　　根据文献2中的方法分析[2]，首先把100ng的Aurora-B激酶和不同浓度的化合物在25℃的情况下孵育10分钟，然后后进行空白对照，并同时进行本底对照。对于对照中的反应体系而言，应在各个体系中加入1.5μmol?L-1底物，且在体系中加入25μmol?L-1的ATP，然后进行孵育，孵育到30min之后，在96孔板的每一孔内要加入EDTA，EDTA应为50μl，从而完成反应终止。在96-well streptavidin-coated plate中，要加入双蒸水，其容量为75μl， 并且在其中加入反应体系，其体系容量一般为25μl，然后进行室温孵育，孵育的时间为60min。接着PBS/T洗板后要加入一抗，孵育两个小时，然后再洗板后加入FTTC标记的抗兔IgG二抗，并且孵育半个小时。PBS/T洗板后，运用激发光和发射光来进行测定，其主要测定每一个孔内的荧光计数。然后我们可以运用不同浓度化合物对Aurara-B的制止百分率公式，其公式如下： 　　在公式的得出中，有必要对分子和分母的参数进行描述，分子参数是由各实验组荧光计数均值减去本底均值，而分母的参数时由空白对照组荧光计数的均值减去本底均值而得到。因此不同浓度化合物对Aurara-B的制止百分率公式为： 　　抑制率%=（1-分子/分母）×100% 　　通过公式的运用，并且运用OriginPro7.5软件来进行拟合，能够计算出化合物对体外重组人Aurara-B激酶的IC50。通过计算，可以具体分析出化合物对重组纯化的人Aurora-B激酶的体外抑制作用。 　　4.MTT检测阳性