《细胞工程》PPT课件.pptVIP

细胞工程 原生质体培养和体细胞 杂交 2011级8班 唐元嫚 原生质体的分离与纯化 原生质体的分离 原生质体的纯化与活力测定 原生质体的分离 1、材料的选择 由于叶肉细胞排列疏松，且叶肉原生质体有叶绿体，取材也方便，因此叶肉是最常用的材料。 对于单子叶植物和大多数双子叶植物而言，采用颗粒较小，疏松易碎的胚性愈伤组织及由其建立的胚性悬浮细胞系更容易获得高质量的原生质体，在培养中更容易得到持续的细胞分裂。 无菌幼苗的子叶，下胚轴和根等也可用于原生质体的分离。 供体的年龄，生理状态和生长环境等都可能影响原生质体的得率、质量以及以后的培养和再生，也影响实验的重复性。Eg:从生长在人工气候箱中的烟草植株的叶片获得的结果比田间材料得到的结果较稳定，并易于重复。 2、材料的预处理 作用： 生理状态，增加细胞膜的可能是改变细胞和细胞壁的强度；也可能是改变细胞壁的化学成分或是减轻酶溶液中杂酶对原生质膜的损伤，以提高细胞壁酶解的效率。 方法： （1）暗处理 （2）预培养 （3）预萎焉 （4）预质壁分离 3、分离方法 （1）机械分离法：是早期研究中借助于利器或机械磨损等措施使细胞壁破损，促使原生质体释放的方法。 （2）酶分离法：酶分离法是指用不同种类和浓度的酶处理细胞，将细胞的壁解离，以获得原生质体。 常用酶的种类：纤维素酶（cellulase);果胶酶（pectinase)；半纤维素酶（hemicellulase);崩溃酶（driselase);蜗牛酶（sanailase)。 酶液的配置：一般由不同的酶制品、渗透稳定剂（糖醇、可溶性糖以及无机盐）以及稳定质膜的药品（附加钙盐0.1%）组成，有时也加入少量缓冲剂或其他药品。 （3）分离原生质体： a、两步分离法 b、一步分离法 ①机械法 优点：（1）能排除酶的有害影响；缺点：（1）原生质体的产量低；（2）方法繁琐费力；（3）局限性大 原生质体的纯化与活力测定 1、原生质体的纯化 将包括处理过的材料在内的酶解混合液经过尼龙网或不锈钢网过滤（网孔视原生质体的大小而异），除去大的残渣，然后收集含原生质体的滤液，再洗涤纯化。 方法: （1）沉降法：将滤液低速离心，转速的控制以将原生质体沉淀而细胞碎片等杂质仍然悬浮在上清液为准。 （2）漂浮法：是根据原生质体、细胞或细胞碎片相对密度不同而设计的，但用这种方法纯化，原生质体得率较低。 （3）界面法：是利用高分子聚合物混合液产生两相水溶液的原理，离心可使原生质体处于两液相的界面之间，可获得数量较大的纯净原生质体。 2、原生质体活力的测定 （1）形态特征 形态上完整、含有饱满的细胞质、颜色鲜艳的正常球形原生质体为有活力的原生质体。 （2）活体染色 用0.1%酚番红或Evans蓝染色后进行观察，有活力而质膜完整的原生质体不着色，而死亡的原生质体能被染上色。 （3）其他 还可以用氧电极测定呼吸或测定原生质体的光合活性（绿色细胞）等方法来测定其活力。 真正确定原生质体的活力还是要看原生质体能否进行持续有丝分裂并再生植株。 原生质体培养 培养基 培养方法 原生质体的再生培养 操作实例：三叶半夏的原生质体培养 培养基 1、无机盐 一般认为原生质体培养基中大量元素应比愈伤组织培养基中的浓度低，对其培养效果影响最大的是钙离子浓度和氮源的种类及其浓度。 2、渗透稳定剂 常用的有葡萄糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖醇和麦芽糖等。糖类是培养基中碳源，也同时是培养基渗透势的调节剂。 3、有机成分 含有丰富有机物质的培养基有利于细胞分裂，如被广泛应用于原生质体培养的KM8p培养基。 4、植物生长物质 一般认为，在培养基中加入2,4-D对分化却有抑制作用，因此，在愈伤组织形成后应该及时调整激素的种类和浓度。 培养方法 1、液体培养 （1）液体浅层培养 将一定的原生质体悬液在培养皿底铺一薄层，封口后进行培养。 （2）微滴培养 微滴的大小很重要 2、固体培养-琼脂糖包埋 利用低熔点琼脂糖，可在30度左右溶化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动。（对混合时的温度要求十分严格） 3、液体-固体结合培养 （1）双层培养 固体培养和液体浅层培养相结合 （2）琼脂糖珠培养 通过调整液体培养基的渗透势来调节培养物的渗透势，以利于其进一步的生长和发育。 4、饲喂层培养 用洗涤过的经辐射处理过的原生质体作为饲喂层，再将未经辐射的原生质体铺在上面进行培养。 原生质体再生培养 原生质体的再