蛋白提取、western.docVIP

Western Blot操作步骤 1、细胞总蛋白的提取 用胰酶-EDTA将贴壁生长的细胞消化，用PBS溶液洗3次，弃去PBS溶液后，加入适量体积的蛋白提取液（1ml预冷的Lysis Buffer加入5μl磷酸酶抑制剂1μl蛋白酶抑制剂和5μl 100Mm PMSF），旋涡振荡器混匀，冰浴振荡15min。于4℃，12000rpm离心20min，收集上清液，分装于Ep管中，-80℃保存℃即可）。可取少量蛋白用于蛋白定量。 2、配制12%分离胶（总体积为ml） 取三蒸水2l，30%丙烯酰胺2l，分离胶buffer l（小分子量蛋白用15%分离胶：分别为三蒸水30%丙烯酰胺分离胶buffer ，SDS 60μl，TEMED 6μl，10%过硫酸铵30μl。混匀后，倒入放置好的胶板中。在液面上加一层无水正丁醇，使液面平整。待胶完全凝固后，倒掉正丁醇，用三蒸水冲洗几次，其余液体用滤纸吸净。 3、配制5%浓缩胶（总体积为2ml） 取三蒸水1l，30%丙烯酰胺333μl，浓缩胶buffer 5l，SDS 20μl，TEMED 4μl，10%过硫酸铵20μl，混匀后，加在分离胶的上层，插入梳子（注意不要有气泡），待胶凝固。 4、处理蛋白样品 自冰箱中拿出蛋白样品，加入5×上样缓冲液，在沸水中煮5min（锅盖打开） 5、上样 待浓缩胶完全凝固后，将胶板放于电泳槽中。加入电泳缓冲液，拔出梳子，用微量加样针在各加样孔中加入适量体积的处理过的蛋白样品。若有不用的加样孔，可加入上样缓冲液6、电泳接通电源，进行电泳。一般溴酚蓝跑到底部时结束电泳。 7、转膜 电泳结束后，将含有目的蛋白的分离胶切割下来，放入转移缓冲液中；根据胶的大小剪裁等面积的6张滤纸和1张PVDF膜，剪裁的PVDF膜可比胶的长宽各长出1mm左右。6张滤纸放入转移缓冲液中；PVDF膜先放入甲醇中活化15sec），再放入转移缓冲液中平衡15min后，依次在石墨电极上叠放3张滤纸、PVDF膜、SDS凝胶和另外3张滤纸。接通电源，40min～60min转膜结束。 8、封闭将转移后的PVDF膜放入5%脱脂奶粉，振荡封闭至少1h。 9、与一抗结合 用抗体稀释液将一抗按1：1000稀释。将PVDF膜直接放入一抗稀释液中，室温振荡孵育2h。 10、洗膜用TBST洗膜，10min/次，共3次。 11、与二抗结合 将洗后的PVDF膜放入二抗溶液中，二抗的稀释度为1：5000。室温振荡孵育1h。 12、洗膜用TBST洗膜，10min/次，共3次。 13、化学发光、显影、定影 此操作在暗室中进行。将发光试剂A和B等体积混合后加在PVDF膜的蛋白面上，室温下孵育3min。将PVDF膜用保鲜膜包好放在暗盒内。在红灯下取出X胶片，放在膜上，根据信号的强弱调整曝光时间。曝光结束后取出X胶片，浸入显影液中显影，显影2～5min，用水终止显影。然后将X胶片浸入定影液中，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。 14、结果处理将胶片进行拍照。用凝胶图象处理系统分析目标带的光密度值。