第8章 人工设计蛋白质分子.ppt

第八章 人工设计蛋白质分子 一. 人工设计蛋白质分子的意义 天然蛋白质分子都是来自生物细胞的。在细胞内，各种蛋白质都可以发挥最大的能力进行各种特定的生命活动。 但当将这些蛋白质从细胞提取出来用于各种工业环境时，往往就不能行使各种特定的功能，原因就是这些蛋白质不适应体外的环境。 要使蛋白质分子能够适应各种体外的工业环境，就必须将天然的蛋白质分子进行改造，使其能适应各种特定的条件。 要对天然蛋白质分子进行改造，就必须进行分子设计，以便改善分子的物理性质和化学性质，以提高分子的热稳定性、抗氧化性、抗还原性、对pH值的稳定性、以及改善其作用专一性等。 二. 小改—少数残基的变换 小改是指对已知结构的天然蛋白质进行少数残基的替换。 这种方法的主要技术就是对生物基因的定点突变技术和盒式突变技术，将天然蛋白质分子原有的一级结构进行少数氨基酸替换，借以改善蛋白质的性质和功能。 在改造中，如何恰当地选择突变的目标残基是一个最关键的问题。这不仅要分析残基的性质，同时还要借助该蛋白质的原有三维空间结构或分子模型。 小改的步骤： 1. 建立天然蛋白质的结构模型:可以通过X射线晶体学、二维核磁共振等技术测定分子结构。 2. 找出对所要求的性质有重要影响的位置。这是一个关键步骤。具体方法可以将同一个家族的蛋白质序列进行对比、分析，从而确定影响蛋白质某些特定性质的关键位置。 3. 在所选出的位点上选择正确的残基来取代.选择残基要综合考虑其疏水性、亲水性、侧链大小和位阻效应、带电基团的极性效应等。总的原则是对其原有结构不要作太大的改变。 4.预测突变体的立体结构。 5. 按路线进行突变操作。 6. 检查突变后的实际效果. 实例: 核糖核酸酶:原有残基104个,2对二硫键.为了增强抗热性,引入第三对工程二硫键.结果,突变体在保持天然酶活性的基础上大幅度提高了热稳定性. T4噬菌体溶菌酶:不含有二硫键,但有2个半胱氨酸.用定点突变技术引入三对二硫键,结果突变体分别含有1对、2对、3对二硫键。所有突变体在氧化状态下比原蛋白质更加稳定，二硫键越多，突变体就越稳定。 三. 中改----分子剪裁 中改是指在蛋白质中替换一个肽段或者一个结构域. 蛋白质的结构可以看作是由不同结构元件组成的.因而可以在不同蛋白质片断之间替换结构元件,期望能够转移相应的功能. 抗体分子由两条重链和两条轻链构成,有12个结构域. 抗原识别部位位于分子顶部1个结构域的高度可变区.抗体和抗原分子互补结合的区域是由可变区的一些肽段构成的. Winter等人利用分子剪裁技术将小鼠抗体重链互补决定子转移到人的抗体分子上去,并获得成功,并具有较强的生物学活性.有重要的医学价值. 四. 大改------从头设计 从头设计蛋白质分子是指从氨基酸残基出发,即从一级结构出发,设计制造自然界中不存在的全新蛋白质,使之具有特定的空间结构和预期的功能. 一般地说,只有当人们完全掌握了一级结构决定高级结构的规律,掌握了高级结构与生物功能的相关性,才有可能真正地从头设计.显然,这是一项尖端技术. 步骤 1.选定目标,确定所需要建造的三级结构,要求对蛋白质的结构与功能的关系有清楚的了解. 目前情况下,只能设计分子量较小的蛋白质分子,如:四螺旋束结构、上下β－折叠筒结构、希腊钥匙型结构等。分子量较大的分子尚未能设计。 2.序列设计:所设计的序列尽量不与天然的序列相同或相似,充分考虑每种氨基酸形成各种二级结构的能力. 螺旋:Leu、Glu、Met、Ala等； 折叠：Val、Ile、Tyr、Phe等； 转角：Asn、Gly、Pro、Asp等。 要考虑疏水相互作用、螺旋偶极作用、静电相互作用、空间堆积等，尽可能形成预定的二级结构。 3. 预测所设计序列的二级结构。 4. 在实验室人工合成或基因工程技术表达. 1)固相合成技术:使用较多,效果好. 2)基因工程技术:合成相应的核苷酸序列,导入细菌DNA中去，让其表达。 5. 产品纯化,功能测试. 一些成果: 1) 美国杜邦公司:四螺旋束结构.74个残基.用作农药. 2) Richardson夫妇:四螺旋束结构.称为FELIX. 3)