脉冲电场对宫颈癌细胞的杀伤作用研究.docVIP

不可逆性电穿孔致Hela细胞凋亡与坏死的作用研究 周玮1，熊正爱1，刘颖1，李成祥2，姚陈果2 （1.重庆医科大学附属第二医院，重庆，400010；2．重庆大学输配电装备及系统安全与新技术国家重点实验室，重庆，400030） 摘要 目的 探讨脉冲电场不可逆性电穿孔处理Hela细胞时，发生细胞膜电穿孔、细胞凋亡、细胞坏死与脉冲电场的关系。 方法 采用固定脉宽100μs、频率1Hz、脉冲数8个，电压由100V逐级升至1000V的脉冲电场处理Hela细胞。利用PI示踪，流式细胞术检测研究Hela细胞膜发生穿孔的阈值电场剂量；CCK-8（cell counting kit-8,CCK-8） μs), frequency(1Hz) and pulses(8 pieces) performed on Hela cells. The voltage was from 100V to 1000V and the amplification was 100V of each group. Propidium Iodide(PI) was used to tracing the breakdown of cytomenmbrane, then detected with flow cytometry according to the manufacturer’s protocol. CCK-8 (cell counting kit-8,CCK-8） asthreshold of Hela cells was 750V/cm. The apoptotic threshold was between 1250V/cm to 1500V/cm. The necrotic threshold was about 1750V/cm. Conclusion Besides necrosis due to IRE, apoptosis also played an important roll during IRE ablating Hela cells. The areas of PEFs parameters inducing apoptosis and necrosis were overlapped each other. Key words：Pulse electric fields, Hela cells, Irreversible electroporation, Apoptosis 一定参数的脉冲电场（pulse electric fields, PEFs）作用下细胞膜不可逆性穿孔（irreversible electroporation, IRE）是不可逆性电击穿治疗恶性肿瘤的理论基础[1]。既往的研究结果认为，肿瘤细胞死亡的直接原因是细胞膜不可逆性的亲水通道形成，胞外基质以及其他分子涌入细胞，导致肿瘤细胞崩解坏死，是一种对细胞即刻的破坏效应[2]。但是我们在前期实验中发现，不可逆性电穿孔治疗恶性肿瘤时也存在肿瘤细胞凋亡的现象。推测随着电场衰减，在一定的较低电场能量作用下肿瘤细胞并没有被直接杀灭，可能会通过特定途径启动肿瘤细胞的死亡程序，进而发生凋亡。本研究以人宫颈癌细胞系Hela为研究对象，系统的探讨肿瘤细胞发生穿孔、凋亡以及坏死与不同剂量脉冲电场之间的关系，为寻求脉冲电场IRE的最佳参数组合提供初步依据。 材料与方法 1.1细胞株及试剂 人宫颈癌Hela细胞株由重庆医科大学超声工程研究所提供；RPMI1640培养液，PBS平衡液，新生小牛血清均购自（Hyclone）；CCK-8 kit购自（碧云天）；PI购自（Sigma）；Annexin V kit购自（美国BD公司）。 1.2 仪器 脉冲电场肿瘤治疗仪（重庆大学输配电装备及系统安全与新技术国家重点实验室制造）；电击小室（BIO-RAD公司，电极板间距4mm）；示波器（Tektronix TDS3032B USA），流式细胞仪FACSVantage SE（美国BD公司）。 1.3细胞培养 人宫颈癌细胞系Hela利用含10%新生小牛血清的RPMI1640培养液置于37℃、5%CO2培养箱内培养，细胞均贴壁生长，2—3天传代一次。 1.4 PI示踪穿孔 取对数生长期Hela细胞，0.25%胰酶消化后离心，PBS液清洗、离心、重悬，调整细胞浓度为2×106/ml。向细胞悬液中加入PI染液，使终浓度为20μg/ml。实验组每组均取760μl混有PI的细胞悬液加入电击小室，分别施加以脉冲电场处理（脉宽100μs，频率1Hz，脉冲8个），电压值由100V起，以100V为梯度逐级增加至1000V共10组。本实验中应用的电击小室电极板间距为4mm，根据公式[电场强度=电压/距离]，100V电压对应的电场