动脉粥样软化病模型蛋白质组及其方法学研究.pdf

扉 页 指导小组成员 杨 苋 原 教授 张祥 民 教授 孔继 烈 教授 刘 宝 红 教授 邱德 仁 教授 木篙鬻擎忍 复旦大学博士论文 动脉粥样硬化疾病模型 蛋白质组及其方法学研究 摘 要 疾病蛋白组学研究是目前蛋白质组学在应用研究方面最具前景的领域。它 对探讨重大疾病的发生机制、诊断和新药开发提供重要的理论依据。 本论文的主要贡献在于：首次用蛋白组学的研究方法对新建立的动脉粥样 硬化(AS)大鼠模型的主要病变组织：主动脉及心肌总蛋白作了详尽的研究。 得到正常大鼠及AS大鼠主动脉及心肌蛋白的差异谱图。分析鉴定了差异蛋白对 AS疾病形成中所表达的功能。泡沫细胞是动脉粥样硬化斑块内出现的特征性病 理细胞，本工作在对AS差异蛋白研究的基础上，进一步研究了巨噬源性泡沫细 胞的磷酸化蛋白谱图，初步阐明了所鉴定的磷酸化蛋白在AS痫变细胞的形成和 增殖中的机制。另外，本研究建立了一种分组提取人肝组织蛋白的研究平台，能 提取到迄今为止的人肝组织中最多的蛋白并对提取的蛋白进行了质谱鉴定。最 后，本文建立了凝胶分离后蛋白质溶液酶解的技术平台，该方法将肽段回收率提 高到90％，并且由于此方法能很方便的与其它方法如免疫印迹相结合而有望成为 翻译后修饰蛋白分析的实用平台。具体叙述如下。 Heart (一)．冠心病(CoronaryDisease，CHD)金称为冠状动脉粥样硬化 为“人类的第一杀手”。目前人们普遍关注针对AS发病机制寻找有效的防治药物， 但AS的病理机制仍未十分明确，传统的分予生物学手段难以对AS多种致病蛋 白作出全面的分析。 为深入探讨AS的发病机制，本研究工作采用一次性腹腔注射维生素D3结 合喂食高脂饲料诱发大鼠全身性AS病变，建立大鼠AS模型，并导致冠状动脉 等器官性血管病变，为AS导致的器官性病变研究提供了可靠的病理模型。实验 比较研究了正常大鼠和AS大鼠主动脉及心肌在蛋白质组学上的差异。采用双向 凝胶电泳分离正常大鼠及AS大鼠主动脉及心肌总蛋白，胶态考马斯亮兰G．250 染色，GS一800凝胶扫描仪获取凝胶图像，并用PDQUEST软件对图像进行分析。 对于正常太鼠以及AS大鼠主动脉的双向凝胶图，检测出1878士100个蛋白质斑 复旦大学博士论叉 点，在相同的参数设置下，不同谱图间的匹配斑点数为1239，匹配率达66％以 上。对比分析了两种主动脉组织的差异蛋白，其中上调的蛋白点有63个，下调 的蛋白点有161个，仅在正常大鼠主动脉中检测到的蛋白点有26个；对于正常 大鼠以及AS大鼠心肌的双向凝胶图，检测出2626士100个蛋白质斑点，在相同 的参数设置下，不同谱图间的匹配斑点数为1841，匹配率达70．1％以Ai。通过分 析两种心肌组织的差异蛋白，发现33个蛋白质斑点只在正常大鼠心肌蛋白检测 到表达：70个蛋白点在两种心肌组织中表达量上有显著变化，其中31个点明显 下调，39点明显上调。 对这两种蛋白质组表达差异谱的分析结果有力地说明了细胞内很多蛋白成 分在病变过程中发生了变化。为了进一步理解发生变化的蛋白及其功能，实验通 个分布在凝胶图谱中各个范围的蛋白进行了鉴定，这些蛋白对于全面认识大鼠 AS在蛋白质水平上的变化起着重要作用。 本论文着重对正常大鼠及AS大鼠主动脉及心肌组织中表达量发生变化的 蛋白质点进行功能讨论。在鉴定的差异蛋白点中，大致可以分为5大类：第一类 是结构蛋白如肌球蛋白等：第二类是与各种脂代谢有关的酶，包括磷酸碱脂 (CTP—B)，胞苷转移酶，磷酸甘油醛脱氢酶等，它们在动脉粥样硬化脂蛋白代 谢的磷酸酯生物合成中具有重要作用；第三类是信号转导蛋白如Bor94蛋白等， 它们在细胞骨架形成中起着重要的作用；第四类是转运蛋白如广泛存在于真核细 胞中的一类核酸结合蛋白如锌指蛋白等，它们在基因的表达调控、细胞分化、机 体生长、配子形成等生命过程中起着非常重要的作用；第五类为其它蛋白。 总之，所鉴定的这些蛋白质参与了病变细胞恶性生长、去分化、和其它表 型与生物学特征改变的调节与控制，可以进～步发现与病理改变有关的蛋白质和 疾病特异性蛋白质。这些