Hsp70,Toll样受体4抗体与自身免疫性内耳病关系.docVIP

Hsp70,Toll样受体4抗体与自身免疫性内耳病的关系 【摘要】 目的： 建立一种自身免疫性内耳病的动物模型，寻求Toll样受体4抗体与Hsp70的关系. 方法： 提取豚鼠内耳膜迷路组织为抗原. 将豚鼠用环磷酰胺预处理，将抗原与等量弗氏完全佐剂一起免疫豚鼠，观测Hsp70在内耳的表达；通过鼓室注射Toll样受体4抗体，再观测Hsp70在内耳的表达. 结果： 免疫豚鼠后听性脑干反应阈显著提高，内耳出现显著的炎细胞浸润，Hsp70的表达增强， TNFα, NFκB的表达增多，血清中检测到抗Hsp70抗体；加入Toll样受体4抗体后Hsp70的表达减弱，炎细胞减少，TNFα, NFκB的表达降低. 结论： Toll样受体4抗体可下调Hsp70在自身免疫性内耳病中的表达. 【关键词】 热休克蛋白70 抗体 自身免疫疾病 耳蜗 豚鼠 0引言 有研究表明Toll样受体4（Tolllike receptor 4, TLR4）可能介导热休克蛋白70（Hsp70）的信号传导，Hsp70是TLR4的内源性配体［1］. 我们以同种异体内耳组织为抗原免疫豚鼠，建立一种高阳性率听力损害的自身免疫性内耳病（autoimmune inner ear disease, AIED）的动物模型，在鼓室注射Toll样受体4阻断剂即Toll样受体4抗体前后，观察模型动物耳蜗组织中的Hsp70表达情况. 1材料和方法 1.1材料耳廓反射正常、无中耳感染、体质量250～400 g的健康、白色、短毛、红目豚鼠75只，雌雄不拘（重庆医科大学动物实验中心）. 其中25只用于提制内耳抗原，其余50只随机分为实验组［20只，给予环磷酰胺（CTX）和粗制内耳抗原接种处理］；处理组（10只，给予CTX和粗制内耳抗原接种处理后施加干预因素Toll样受体4抗体）；对照1组（10只，只给予CTX预处理）；对照2组（10只，不施加任何因素），分笼后适应性喂养1 wk. TLR4 Ab［FG Purified antihuman TLR4（HTA125），美国eBioscience公司］；苯甲基磺酰氟（PMSF，碧云天生物技术研究所）；鼠抗Hsp70 mAb、弗氏完全佐剂(CFA)（美国Sigma公司），大鼠抗核因子кB（p65）mAb（Santa Cruz公司），均由北京中山公司分装；TNFα ELISA试剂盒（晶美公司）；抑肽酶、DAB 显色系列购自北京中山公司；CTX购自重庆医科大学附属一院药房. 1.2方法 1.2.1内耳抗原的提制豚鼠25只，用速眠新0.1 mL/kg肌肉注射麻醉后断头处死,参照文献［2］的方法提制粗制内耳抗原液，用酶标仪检测内耳抗原液浓度，并在-70℃分装保存备用. 1.2.2免疫动物将实验组豚鼠腹腔注射CTX(150 mg/kg)进行预处理，2 d后对每只豚鼠用粗制内耳抗原液与弗氏完全佐剂等量乳化液400 μg粗制内耳抗原蛋白量共0.2 mL进行颈、背部、足部皮内多点注射接种［2］. 处理组按实验组的方法免疫豚鼠，2 d后每只豚鼠经鼓室注射TLR4阻断剂100 μg. 1.2.3内耳石蜡切片的制作将动物麻醉后快速断头，取出听泡，经40 mg/L多聚甲醛固定， 100 mg/L EDTANa2脱钙后，OCT包埋标本，沿耳蜗中轴切片，片厚5 μm. 1.2.4检测指标 1.2.4.1听性脑干反应（ABR）测试所有动物在免疫前均行ABR测试,实验组动物免疫后1 wk,处理组于处理因素后1 wk,对照组在处死前均再接受ABR测试. 豚鼠麻醉后，在静电屏蔽室内行双侧ABR测试，短声刺激，扫描周期10 ms，滤波带宽100～300 Hz，信号叠加1000次，以ABR波Ⅲ反应阈为标准判断听阈. 1.2.4.2豚鼠耳蜗Hsp70的表达取实验组动物听阈超过10 dB的10耳，并随机选取处理组和对照组的10耳，耳蜗切片做免疫组化染色（SABC法）. 切片用0.3 mL/L甲醇H2O2液处理；山羊血清封闭；加一抗（鼠抗Hsp70 mAb 1∶100）37℃孵育1 h，并用普通小鼠IgG(1∶100)取代一抗作阴性对照；滴加二抗（生物素化羊抗小鼠IgG,即用型）在37℃反应30 min；二氨基联苯胺（DAB）显色，常规脱水、透明、中性树胶封片. 胞核及胞质呈棕黄色染色为阳性. 在上述各组的切片中,每耳分别随机抽出1张近中轴的切片,做统计学分析. 每张切片随机选取10个视野计数300个螺旋神经节细胞，依照阳性细胞百分比判断，阳性率lt;10%(-)、阳性率10%~25%(+)、阳性率26%~50%()、阳性率gt;50%(). 1.2.4.3耳蜗中NFκB（p65）的表达用SABC法，方法及结果判定同上,以缓冲液