酶工程第9章兰州大学酶工程酶蛋白的化学修饰.pptVIP

第九章 酶蛋白的化学修饰 一、为什么要对酶进行化学修饰 酶应用的缺点 酶应用的缺点 酶应用的缺点 酶改造的两个水平 二、酶化学修饰的基本原理 酶化学修饰的基本原理 酶化学修饰的基本原理 酶化学修饰的基本原理 酶化学修饰的基本原理 三、酶化学修饰方法的设计 设计酶化学修饰方法时的注意事项 设计酶化学修饰方法时的注意事项 四、修饰剂及修饰反应 高碘酸氧化法 糖及糖的衍生物 糖肽修饰方法 糖肽修饰方法 糖及糖的衍生物 2．聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG） 聚乙二醇修饰方法 聚乙二醇修饰方法 聚乙二醇修饰方法 N-羧氨基苯甲酐为修饰剂 酶修饰程度与抗原性 PEG修饰酶的酶活回收率 3．合成大分子多聚物 PVP修饰法 4．肝素 肝素的碳二亚胺法修饰 5．血浆蛋白质 血浆蛋白质修饰法 血浆蛋白质修饰法 白蛋白活性酯法修饰 6．琥珀酸酐 L-天冬酰胺酶琥珀酰化修饰程度与酶活性的关系 7．金属离子置换 金属离子置换 金属离子置换的方法 五、修饰酶的性质特征 修饰酶的性质特征 天然酶和修饰酶热稳定性的比较 修饰酶的性质特征 修饰酶的性质特征 乙酸酐和MPEG1修饰L-天冬酰胺酶的抗原性 修饰酶的性质特征 修饰酶的性质特征 对组织的分布能力 对组织的分布能力 对组织的分布能力 修饰酶的性质特征 血浆蛋白质是血浆中的天然组分，它们与外源蛋白质（包括酶）的复合物在血液中有可能被视为“自体蛋白”而被接受，同时由于血浆蛋白质具有较大的分子量，在改进酶的性质方面效果更明显。因此，已被认为是具有较大优越性和发展前途的修饰剂。其中人血清白蛋白是研究较多的一种酶修饰剂。 （1）戊二醛法 （2）活性酯法 白蛋白的活性酯修饰法反应条件温和，避免了活泼的双功能交联剂直接与酶接触所产生的酶失活，减少了副反应的发生。用活性酯法以白蛋白修饰尿激酶，在不用底物保护酶活性部位的条件下，酶活回收率仍高达90％以上，结合率高达80％以上。白蛋白的琥珀酰化应在碱性条件下进行，与对硝基苯酚的反应要在偏酸性pH下进行。 从大肠杆菌得到的L-天冬酰胺酶由四个亚基组成，当用琥珀酸酐在碱性条件下修饰酶的赖氨酸残基时，不同的反应条件得到了不同的结果。当酶分子中15～25％的赖氨酸被修饰后，酶活性有所提高，当40％的赖氨酸被修饰后，酶仍保留了全部活性，因此可以认为这部分基团与酶活性关系不大。随着修饰程度的增加，大量带正电荷的氨基被带负电荷的羧基侧链取代后，所产生的静电斥力就可能导致酶亚基的解离和分子内部的氨基被修饰，从而使酶活性降低。 0 0.10 0.50 0.60 0.72 1.00 1.25 1.16 酶活性 ／对照酶活性 0.93 0.82 0.65 0.57 0.50 0.40 0.22 0.15 琥珀酰化LYS ／总LYS 8.0 6.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.50 0.25 琥珀酸酐 ／LYS 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的功能和特性发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。通过金属离子置换修饰，可以了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，有利于阐明酶的催化作用机制，并有可能提高酶活性，增强酶的稳定性，甚至改变酶的某些动力学性质。 有些酶分子中含有金属离子，而且往往是酶活性中心的组成部分，例如α－淀粉酶中的Ca2+、谷氨酸脱氢酶中的Zn2+、过氧化氢酶中的Fe2+、超氧化物歧化酶中的Cu2+、Zn2+等。若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性，有的可以使酶活性降低甚至丧失，有的却可以使酶活性提高或增加酶的稳定性。 金属离子的置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。例如，Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等。在离子置换修饰时，先在经过分离纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如EDTA，使酶分子中的金属离子与EDTA形成螯合物，通过透析、超滤、凝胶层析等方法，将EDTA－金属离子螯合物从酶液中除去。然后将另一种金属离子加到酶液中，酶蛋白与新加入的金属离子结合，就得到经过金属离子置换的酶。 1．提高酶活性 有些酶通过金属离子置换后显著地提高了酶活性。如α－淀粉酶分子中大多数含有钙离子，有些含有镁离子和锌离子，所以一般的α－淀粉酶是杂离子型的。如果将杂离子都置换成钙离子，则可以提高酶活性3倍以上，并显著增强酶的稳定性。所以在α－淀粉酶的发酵生产、保存及应用过程中，添加一定量的钙离子，有利于提高和稳定α－淀粉酶的活性。再如，将锌型蛋白酶