p38MAPK在慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠肾组织表达研究.docVIP

p38MAPK在慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠肾组织的表达研究 【摘要】 目的：探讨慢性移植物抗宿主病（cGVHD）狼疮样小鼠肾组织p38MAPK的表达变化,进而分析p38MAPK在狼疮肾炎肾纤维化发生中的作用。方法：将12只雌性(C57BL/6J×DBA/2)F1杂交鼠随机分为模型组及正常对照组,每组6只。于16周末处死，取肾行HE和Masson染色，应用免疫组化方法检测TGF-β1、p38MAPK、P-p38MAPK在肾脏的定位表达，RT-PCR法研究各组肾组织TGF-β1、p38MAPK mRNA的表达,Western blot定量检测TGF-β1、p38MAPK、P-p38MAPK蛋白的表达水平，并观察两组小鼠24h尿蛋白排泄量。结果：与正常对照组比较,模型组小鼠24h尿蛋白排泄量、TGF-β1、p38MAPK和 P-p38MAPK蛋白及mRNA表达均明显增加(P＜0.01),TGF-β1与p38MAPK的表达呈正相关(r=0.418,P＜0.05)。结论：cGVHD狼疮样小鼠肾组织中TGF-β1、p38MAPK和P-p38MAPK蛋白及mRNA表达明显上调,p38MAPK信号通路可能在狼疮肾炎肾纤维化的进程中起重要作用。 【关键词】 慢性移植物抗宿主病； 狼疮肾炎； p38MAPK； 小鼠 狼疮肾炎（lupus nephritis,LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus SLE）最重要的临床表现之一，其病理改变以肾小球、血管、肾小管及其间质损害为特征，最终急性或慢性进展为肾脏纤维化甚至肾功能衰竭。肾脏纤维化不仅是各型LN进展到终末期的共同病理表现，而且也是患者病情的重要反映指标，在其发展过程中，多种因素发挥着重要作用,其中TGF-β1起着关键作用。有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK) 级联是细胞内重要的信号转导系统,它参与胞外信号从表面转导到细胞内部的过程,为细胞内信息传递的共同通路。近年来许多研究结果表明，其亚族p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)作为信号转导通路的交汇点在肾脏纤维化的发生发展中起着重要作用，但在LN肾纤维化的发生过程中是否起作用尚未见报道。因此本研究通过构建慢性移植物抗宿主病(chronic graft versus host disease,cGVHD)狼疮样小鼠模型,探讨作为TGF-β1下游信号介质，p38MAPK在LN发展过程中的表达与活化及其可能的作用机制。 1 材料与方法 1.1 实验动物 8～10周龄雌性(C57BL/6J×DBA/2)F1杂交鼠 (以下称杂交鼠)及6～7周龄DBA/2小鼠购自中山大学医学动物中心,体重(20.17±1.20)g,SPF级，饲养于本校公共卫生学院SPF动物房。 1.2 模型的建立与分组 ［1］制作cGVHD狼疮样小鼠模型。按随机、对照设计原则将12只杂交鼠分成模型组及正常对照组,每组6只。取DBA/2小鼠脾脏、胸腺、淋巴结细胞,制成单细胞悬液(约60%脾细胞、30%胸腺及10%淋巴结细胞),分别于0、3、7、10d经尾静脉注射于模型组杂交鼠,用台盼蓝染色和细胞计数板计数,保证活细胞数大于95%,且每次给予细胞数为50×106个。正常对照组则于相应时间经尾静脉注射等体积生理盐水。两组小鼠首次尾静脉注射后每两周留取1次24h尿,至16周处死动物，立即取下肾脏,一部分置于-70℃低温保存,另一部分置于10%中性福尔马林溶液中固定后行组织病理学检查。 1.3 24h尿蛋白量测定 用双缩脲比色法测定尿蛋白,小鼠尿液1∶5稀释后按操作说明书操作。 1.4 RT-PCR 1.4.1 总RNA提取 从-70℃低温冰箱中取出肾组织,迅速用Trizol(晶美生物技术有限公司)匀浆提取总RNA。取5μl总RNA进行甲醛变性凝胶电泳,紫外灯下观察5、18、28s条带清晰提示RNA完整无降解。 1.4.2 逆转录 逆转录反应体系如下:在PCR管中加入10×逆转录缓冲液1μl,MgCl2(25mmol·L-1)2μl,Oligo dT 1μl,dNTPs(10mmol·L-1)2μl,RNase inhibitor 0.25μl,AMV逆转录酶(TaKaRa公司)1μl,总RNA 2.75μl,30℃ 10min后42℃逆转录50 min,99℃灭活逆转录酶5 min,5℃ 5 min,所得cDNA保存于-20℃用于PCR扩增。 1.4.3 PCR扩增 TGF-β1、p38MAPK及GAPDH内参照引物用DNA Club软件设计,由上海英骏生物工程公司合成,序列如下:p38MAPK上游引物5′-tcgagaccgtttcagtccat-3′,下游