丝组及组丝二与蛋白质的相互作用.pdfVIP

V 上67663l 摘要 10年前，赵玉芬院士负责的研究小组发现了磷酰化氨基酸具有自组装功能， 并以此提出了磷酰化氨基酸是生命化学进化的最基本单元的理论，并相继发现 了基于这一理论的产物磷酰化丝氨酸、丝组二肽具有核酸、蛋白质以及脂的切 割功能，这些生物活性分子所具有的功能可以说体现了现代酶的雏形，也进一 步验证和提升了“磷酰化氨基酸是生命化学进化的最基本单元的理论”。同时， 这些发现对著名的“RNA世界”的理论提出了挑战，为从化学进化的角度探索 生命起源提供了全新的视角。特别是越来越多的蛋白质酶作用机制的研究表明， 丝氨酸和组氨酸是许多蛋白酶活性中心必不可少的功能氨基酸。丝组二肽切割 功能的发现，说明了丝氨酸和组氨酸作为活性中心的主要功能氨繁酸是蛋白酶 长期进化和选择的结果。 本研究利用变性聚丙烯酰胺擞胶电泳(sDs_PAGE)、荧光分光光度技术、圆 定量、底物选择性、切割机制等方面进行了较为深入的研究，并对组丝二肽(IIS) 与蛋白质的相互作用进行了相应的对比研究。同时对利用丝组二肽的蛋白质切 割功能设计模拟抗体酶以及利用竞争ELSIA法筛选肽活性物质的方法进行了探 索。主要研究结果如下： 1， 系下，当反应温度为50℃时的切割速度为4．63×i0～mM／hr，其切割活性相 割，而柠檬酸却对sH的切割具有抑制作用。 2， 通过用SDS—PAGE结合荧光光谱技术研究发现丝组二肽对蛋白质的 切割活性具有一定程度的底物选择性，主要表现为对a一螺旋含量较高的蛋白质 切割活性较低，而对D折叠以及自由LOOP区含量较高的蛋白质具有较高的切 割活性。利用LC／MS／MS对切割碎片进行分析发现，在蛋白质的～级结构上， SH对蛋白质的切割具有一定程度的氨基酸序列偏好性，主要表现为其高频短裂 点在甘氨酸位点。其二级结构的选择性和序列偏好性的一致性说明蛋白质的位 阻效应是影响SH二肽中丝氨酸羟基亲核进攻肽键的主要因素之一。 3， 在用荧光光谱技术对丝组二肽的切割活性进行实时跟踪时发现，丝 组二肽在近中性的室温条件下，可以对GFP的荧光产生一定程度的淬灭作用， 而组丝二肽却表现出对GFP荧光的增强作用，同时其淬灭或增强的程度同样表 现出一定程度的底物选择性。通过用CD与SDS．PAGE相结合的方法对丝组与 组丝二肽与GFP的这种相互作用关系的研究发现，丝组与组丝均可以与GFP发 生一定程度的弱相互作用，用SDS可以在室温条件下捕获到HS与GFP 结合的一条滞后的结合带，用标准分子量方法估算出HS与GFP的结合量为 1l一29个HS／P。 4， 丝组二肽与组丝二肽弱相互作用的圆二色性分析结果表明，在GFP 溶液中加入丝组二肽对GFP的立体构像影响不大，说明引起荧光淬灭的主要原 因是sH与GFP的弱相互作用影响了GFF对激发光的吸收，从而表现出GFP荧光 强度的下降。而Hs的作用则正好相反。 5， 探讨了利用竞争法酶联免疫技术(ELSIA)，对合成肽库中的肽活性 物质进行初步筛选的可行性。结果表明，二肽以及二肽类似物的蛋白质切割活 性与ELSIA结果具有很好的一致性，说明该技术可以作为肽库活性物质的初选 技术。 6， 探讨了基于丝组二肽切割功能的模拟抗体酶设计的可行性，设计了 3种sH与乙肝抗原可变区融合表达的融合蛋白，利用生物传感技术对其切割功 能进行了测试，结果发现虽然融合蛋白仍然保留了原有抗体的抗原结合活性， 但并没有实现预期的对特异抗原的l刃割。可能的原因是与抗体融合后的sH链其 构像的改变不利于sH对蛋白质的切割，因此有待于对sH的联接的方式以及与 蛋白质的连接臂． that wereformed Ten discoved by group polypeptides yearsago，our th