细胞色素c氧酶亚基Ⅱ可溶性结构域的结构改变、转换和功能研讨.pdf

摘 要 细胞色素c氧化酶是哺乳动物线粒体或细菌呼吸链上的末端酶，催化电子 从细胞色素c到02的转移并使后者还原为水。该酶是一个复合的膜蛋白，包 括多个亚基及不同的金属活性中心。其中，亚基II中的CuA中心被认为是电子 从细胞色素c进入该酶的入口，在生理过程中起着重要作用。细胞色素c氧化 酶的缺损或不足可导致许多疾病，在一些退行性疾病(如：老年痴呆症)或癌症 研究中已发现了与其相关的基因突变。本工作以该酶的亚基II可溶区为研究对 象，成功表达并获得了Paracoccus 重组蛋白(128．280位的氨基酸序列)；通过基因工程方法构建突变体蛋白，研究 化学因素引起的蛋白结构改变、转换，以及与此相关的性质和功能变化。主要工 作和结果如下： (一)细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ可溶区蛋白的体外表达、纯化及性质表征 以大肠杆菌BL2l(DE3)为表达载体，建立并优化了表达条件，获得了细菌 Paracoccu8 versutus的细胞色素C氧化酶皿基Ⅱ可溶区重组蛋白。该蛋白大量 存在于包涵体中，通过体外复性，金属中心重组和FPLC纯化，获得了水溶性的 紫色蛋白，在SDS—PAGE中表现为单一条带。经电喷雾质谱测定分子量，蛋白 的成功制备得到了进一步确证。 采用紫外-可见和园二色谱表征了蛋白的金属活性中心和二级结构。紫外可 见光谱显示出明显的CuA特征，360，480，530和810lqrll的吸收带是双核混 价铜中心的特有贡献：在园二色谱中，215nm附近的负峰是B．折叠的典型特征。 这些光谱学特征与文献报导的同类蛋白质基本一致。稳态荧光谱研究提供了有关 亚基II可溶区的三级结构信息，细胞色素c氧化酶亚基II可溶区的最大荧光发 射波长为342±2 nm，主要反映了色氨酸的荧光特征，表明存在着Tyr—Trp 有淬灭作用。采用还原态的细胞色素c，对蛋白的活性也作了检测。通过监测可 nm)的光谱变化，证明细胞色素c氧化酶亚基II可溶区 见区(520，530，550 可以氧化细胞色素c，具有酶活性。 (二)121位色氨酸突变对蛋白结构和功能的影响 细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ中存在一个高度保守的芳香性残基簇(Trpl21， 中心仅有5A，且与Cu^中心的多个配体有相互作用。同时，Trpl21还被看作 是电子从细胞色素c进入细胞色素c氧化酶的入1：3。然而，Trpl21对蛋白结构 所起的作用并不清楚，其影响电子传递的机制尚需进一步探讨。 利用蛋白质工程的定点突变技术，我们构建了121位色氮酸残基的三个突变 大肠杆菌中进行表达，三个突变蛋白的制备过程均与野生型类似。其中，只有 W121Y突变体可以重组Cuh中心，并具有与野生型一致的二级结构特征。突变 体W121L和AWl21均丧失了形成CUA中心的能力，园二色谱研究显示它们 的二级结构也发生了改变，在215hill处的负峰转化为208和220 mn的双负 峰，暗示着蛋白中。卜螺旋和p一折叠含量的相对变化。电子自旋共振fEPR)和 拉曼光谱(Raman)测定表明：在这两个突变体中，特征的CuA配位结构已明 显转换为Ⅱ型Cu”配位。 尤为重要的是，对Trpl21残基的取代明显地影响了蛋白的电子传递功能。 应发现：与野生型相比，突变体W121Y与细胞色素c的电子传递速率减少了七 倍；而在同样条件下，由于Cu^活性中心的破坏和蛋白结构的转换，W121L和 AWl21突变体与细胞色素c几乎不发生电子传递。 研究表明，121位氨基酸残基的芳香性和氢键生成能力对于维系稳定的CUA 中心和天然的构象是必需的，同时也有利于高效的电子转移。用平衡滴定实验分 别测得了野生型和W121Y突变体的电位，比较了可以部分保持电子传递功能的 突变体W121Y与野生型的差异，进一步研究其活性减小的原因。结果表明： W121Y突变体的电位与野生型接近，并非导致其活性下降的主要因素；相应地， 侧链体积的减小及氨基酸突变所引起的微环境的扰动可能起着不可忽略的作用。 (三)野生型及W121位突变体蛋白的稳定性及去折叠研究 结合紫外-可见、园二色谱和稳态荧光光谱，考察了不同条件下细胞色素c 氧化酶亚基II可溶区野生型及突变体的稳定性，并对变性过程中的去折叠机制 进行了探讨。 细胞色素c氧化酶