分子生物学技术在浮游病毒生态学研究中应用.doc

分子生物学技术在浮游病毒生态学研究中的应用摘 要: 病毒是海洋及淡水微生物群落的重要组成部分，在调控微生物环路、驱动生物地球化学循环、维持浮游植物与细菌多样性等方面发挥着重要作用。然而，传统的病毒培养及定量技术难以对浮游病毒群落结构与多样性进行深入而全面的解析。微生物分子生态学技术的快速发展及广泛应用为此提供了新的途径。本文概述了克隆文库分析方法、脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术、DNA指纹图谱、DNA微阵列、宏基因组技术等分子生物学技术方法的基本概念及其在研究浮游病毒的种群结构与遗传多样性及其与环境因素之间的相互关系等方面的应用状况。关键词：分子生物学技术；浮游病毒；分子生态学；群落结构；遗传多样性自20世纪80年代以来，研究人员发现病毒广泛存在于海洋及淡水环境中，构成水生微生物群落的重要组成部分[1]，其丰度高于细菌1–2个数量级别，每升水中的数量高达109个病毒粒子[2]。科学家曾推测，如果将海洋中庞大数量的病毒头尾相连排成一列，长度将比地球附近的60个星系相互间的距离总和还要长[3]。这一惊人发现使得人们对病毒在水环境中的生态学意义有了重新认识，同时也激发了人们对病毒生态学功能的研究兴趣。如今，海洋及淡水中的病毒及其在生态系统中的作用是病毒学与生态学研究相互渗透而成的一个新的研究方向，成为水环境科学研究的热点之一[4, 5]。浮游病毒是一个生态学概念，指悬浮于水体中的各类病毒，包括噬菌体、噬藻体、真核藻病毒和其他动植物病毒等[6]。以原核生物为宿主的噬菌体与噬藻体是浮游病毒的主要类群，具有丰富的遗传多样性。它们虽然个体极为微小，但十分活跃，是水生态系统结构与功能的重要调控者，在调节水体微生物种群大小、结构与多样性方面具有显著作用，而且在微生物食物环、生物地球化学循环、微生物之间的遗传物质转移，以及全球气候变化等方面起着不可忽视的作用[7]。浮游病毒是引起水生态环境中浮游细胞生物死亡的主要因素之一，对影响微生物群落结构演替与水体初级生产力等起着重要作用[8]。浮游病毒的群落结构及多样性研究，有助于人们更加深入地认识浮游病毒在水生态系统中的地位与功能及其宿主微生物之间的相互关系，甚至为开发浮游病毒及其基因资源用于改善与保护水生态环境具有重要意义。对于浮游病毒的研究，最初着重于新病毒的分离鉴定、形态特征、生物学特性以及与宿主相互关系的研究，而关于它们在水体中的种群结构及其与环境因素之间的生态学意义所知甚少。直到20世纪90年代后，随着微生物分子生态学技术在微生物多样性及生态功能研究中的广泛应用，为研究浮游病毒遗传多样性提供了新的方法。微生物分子生态学技术涉及生物学、基因组学和生物信息学等学科的理论知识，主要以病毒基因组 DNA的序列信息为依据，通过检测浮游病毒种群 DNA序列多态性，鉴定个体的基因型，在基因水平评价种群遗传分化，并在分子水平上阐述浮游病毒的组成和群落结构及其动态变化，更好地揭示病毒与环境之间的生态学意义。目前，应用于原位环境中浮游病毒种群结构与多样性研究的微生物分子生态学方法主要包括基于PCR的克隆文库分析方法、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、DNA 指纹图谱、DNA 微阵列和宏基因组文库等。微生物分子生物学技术克服了病毒分离培养的限制，可以在核酸水平上阐明浮游病毒遗传多样性及其动态变化，极大了促进了浮游病毒群落结构与生态学功能的研究。1 克隆文库克隆文库(Cloning library)分析方法是首先从环境样品中提取出浮游病毒基因组总DNA，利用针对病毒的标记基因序列设计通用引物对样品总DNA进行PCR扩增，将PCR产物与合适的克隆载体连接，并转化感受态细胞（大肠杆菌），得到大量含有不同标记基因序列的转化子，然后对这些转化子的标记基因序列采用测序技术或 PCR/RFLP进行定性分析。对于测得的序列，可以通过与GenBank数据库中已有数据的对比鉴定其分类地位，或者分析标记基因序列的类型和相对数量，从而得到浮游病毒群落结构和多样性的信息。利用克隆文库分析方法研究浮游病毒多样性，关键是要确定好合适于浮游病毒检测分析的标记基因。目前，对于浮游病毒体多样性的研究主要采用病毒的结构蛋白基因g20、DNA聚合酶基因和辅助代谢基因等序列作为其检测分子遗传标记。1.1 结构蛋白基因g20结构蛋白g20基因(Structural gene g20)是肌尾病毒科中存在的一段编码结构蛋白基因，其序列相对保守，被作为分子标记用于研究浮游病毒的遗传多样性。研究者采用该基因序列作为遗传标记的研究结果揭示了浮游病毒具有相当丰富遗传多样性，而且不同水环境之间遗传多样性差异较明显。1.2 DNA聚合酶基因DNA聚合酶(DNA Polymerase)是DNA复制所需的一种生化酶，具有高度保守的氨基酸序列，成为研究浮游病毒遗传多样性及其亲缘关系的重要