2009第九章 分子标记与个体鉴别.pptVIP

第九章 分子标记和个体鉴别 分子标记的种类 在药学和法医学上的应用 分子标记的概念 分子标记(molecular markers) 是指可遗传的并可检测的DNA序列 ，是能够用来区分个体特点的DNA片段。 作用在于鉴别个体: 个体间存在的自然遗传变异，进而造成许多遗传序列的多态性，即这些序列在不同的个体表现不同。分子标记就是通过查找和应用这种遗传差异基础上的变异对个体、性状和基因进行鉴别。 鉴别个体 的意义 法医学：根据现场遗留的蛛丝马迹发现罪犯。 遗传学：发现个体之间的相互关系；亲子鉴别。 分类学：鉴别微生物，动植物。研究系统进化。 医药学：发现病原（鉴定病原性微生物）和研究病员的变异。中药鉴定（明确药用动植物，制剂鉴定）。 分子标记的特点 1. 直接以DNA形式表现，与生长发育无关，取材不受限（从本质上解决）。 2.标记的种类和数量多，遍及整个基因组。（有选择余地）。 3.同一标记的多态性高。（有个体鉴别意义）。 分子标记的特点 4. 中性：某些标记不影响目标性状的表达，与不良性状无必然连锁（没有干扰问题）。 在真核生物中，基因组DNA多态性要远远多于各种基因的遗传多态性，因为基因组中存在着大量的不编码的DNA序列，它们的变异不受或较少地受自然选择的制约。 5. 许多分子标记表现为共显性（codominance，两个都对表型有贡献,谁也不占优势）, 能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型。（额外的优势） 分子标记的种类 按照实验技术分类： 第一类：分子杂交为核心 代表：RFLP 第二类：PCR为核心 代表：RAPD、SSR、AFLP 第三类：DNA序列为核心 代表：SNP ITS 第一节、基于杂交技术的分子标记技术 限制性片段长度多态性 RFLP 可变串联重复多态性 VNTR Southern blotting 1.RFLP 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 技术 原理： 限制性内切酶酶切 特定DNA片段的大小 RFLP的产生 （酶切位点变异的突变如点突变 插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）。 RFLP原理图示： RFLP工作流程 RFLP的探针 1.叶绿体、线粒体（基因组序列短不需要探针杂交步骤即可检出多态性）。 2.对于较大的基因组，酶切片段过多会产生重叠序列。需要选择一个或数个遗传位点，用相应的探针产生RFLP。探针通常有两种来源：cDNA和PstI基因组克隆。 cDNA探针：表达基因作探针。利用cDNA文库。 PstI基因组克隆：单拷贝基因（非重复序列）相连接区域均为高度甲基化的序列。 RFLP的应用 鉴定不同品种间的亲缘关系 确定杂交或体细胞杂交品种是否成立 基因定位 以遗传作图为基础的基因克隆 数量遗传研究 数量性状位点QTLs作图 QTLs（quantitative trait loci）位点是指一个基因或一组连锁的基因上该位点变化后能够使特定数量性状发生变异。 数量性状：人身高、动物体重、生育期、果实大小，产量高低等。数量性状的变异呈连续性,杂交后代难以明确分组,只能用度量单位进行测量，并采用统计学方法分析。 决定数量性状的基因数目很多，各基因的效应相等；各基因的作用是累加性的。 举例 番茄的 Brix9-2-5、fw2.2 和 Ovate 分别作用于糖含量、果重和果形。 作图：基因差异比较 性状样本-----AFLP获得多态性位点------统计或区间作图法找到与数量性形状相关的多态性位点。 问题关键： 如何用合适的探针找到相应的位点。 缺点： RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制。确定一个数量性状基因大约需要几年甚至10年时间。 Tanksley 实验室从20世纪80年代末开始研究番茄果实重量的数量遗传，1996年把 fw2.2 定位到第2染色体的约 150 kb 的区域，在2000年完成了克隆工作，前后花了10多年的时间；以色列的 Zamir 研究小组在1995年把1个控制番茄糖度的 QTL Brix9-2-5 定位在第9染色体上大约 9 cM 区域，2000年最终将其鉴定为 Lin5 基因(细胞质外蔗糖转化酶)，也经历了6年的时间。 2、VNTR 可变串联重复（Varible number of tandem repeats，缩写VNTR）包括两种： (1) 小卫星(minisatellite)序列：重复单位(motif)约有