别构调节sigma-1受体在小胶质细胞介导炎症中的作用及其机制研究-study on the role of allosteric regulation of sigma - 1 receptor in microglia-mediated inflammation and its mechanism.docxVIP

别构调节 sigma-1 受体在小胶质细胞介导炎症中的作用及其机制研究 中文摘要目的：研究 sigma-1 受体别构调节剂 SKF83959 对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS) 介导的小胶质细胞炎症反应的抗炎作用以及炎症介质释放所引起的神经毒性的保护 作用，并进一步探讨 SKF83959 抗炎作用的分子机制。方法：利用 LPS 刺激的 BV2 小胶质细胞，MTT 法检测细胞活性；收集 BV2 细 胞培养液上清，分别用 Griess 法和 ELISA 法检测一氧化氮（NO）和肿瘤坏死因子（TNF-α）的含量；收集 BV2 细胞超声破碎后进行蛋白定量，用 ELISA 法检测细胞 内 DHEA 的含量；Quantitative real-time PCR(Q-PCR)方法检测炎症介质 TNF-α、IL-1β 和 iNOS 的 mRNA 表达水平；Western Blot 方法检测 iNOS 蛋白的表达以及 MAPKs 和 IKK/IκBα 蛋白磷酸化水平；收集细胞，流式细胞术检测细胞内活性氧（ROS）的 水平；用放射性配基结合实验测定 SKF83959 对脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone， DHEA）与 sigma-1 受体结合能力的影响；BV2 小胶质细胞条件培养基与 HT-22 海马 神经元细胞共培养，收集细胞，采用流式细胞术检测神经元细胞凋亡水平，研究 SKF83959 对 LPS 介导的 BV2 小胶质细胞炎症介质引起的神经毒性的保护作用。结果：SKF83959 显著抑制 LPS 激活的 BV2 小胶质细胞炎症反应，但被 sigma-1 受体拮抗剂 BD1047 和 BD1063 以及 DHEA 合成抑制剂酮康唑阻断；SKF83959 促进 了 DHEA 与 sigma-1 受体结合，并以正向协同的方式增强了外源性 DHEA 的抗炎作 用；Sigma-1 受体拮抗剂 BD1047 和 BD1063 也阻断了 SKF83959 和 DHEA 的协同抗 炎作用；在小胶质细胞条件培养实验中，SKF83959 可以改善小胶质细胞炎症介质对 HT-22 神经元细胞的神经毒性；SKF83959 的抗炎作用与 MAPK / ERK 和 NFκB 信号 通路激活以及 D1 受体活化并不相关。结论： SKF83959 通过别构调节 sigma-1 受体抑制 BV2 小胶质细胞的炎症反应中文摘要别构调节 sigma-1 受体在小胶质细胞介导炎症中的作用及其机制研究并对激活的小胶质细胞的炎症介质所引起的神经毒性具有保护作用。 关键词：SKF83959；小胶质细胞；炎症反应；DHEA；sigma-1 受体；别构调节作者：伍壮 指导教师：镇学初 教授SKF83959 inhibits microglia mediated inflammation via allosterically modulating sigma-1 receptorsAbstractObject: To investigate the effects of sigma-1 receptor allosteric modulator SKF83959 on microglia-mediated inflammatory response and its mechanism.Methods: We employed LPS-stimulated BV2 microglia to explore anti-inflammatory effect of SKF83959. Cell viability was measured by a colorimetric assay with MTT assay. The levels of NO and TNF-α in culture medium supernatants were measured by Griess and ELISA assay, respectively. Flow cytometry was used to detect the generation of intracellular ROS. TNF-α, IL-1β and iNOS mRNA levels were quantified by Quantitative real-time PCR（Q-PCR）. iNOS , phosphorylation of mitogen-activated protein kinase（sMAPKs）and IκBkinase/inhibitor of nuclear factor-κBα（IKK/ IκBα）protein expression levels