流式所用的玻璃器皿、器械枪尖及试剂均须高压。.ppt

第 二 部 分研 究 型 综 合 实 验 实 验 目 的 研究麦芽糖结合蛋白（Maltose binding protein, MBP)免疫调节作用 MBP 抗肿瘤作用及机制 材 料 的 准 备  按照每组 8 只准备： 小鼠：免疫前两天（11月30日）领 C57BL/6（20 g左右）雌性小鼠 50 只。 10 只 1 ml注射器，10 只灭菌的玻璃小试管。 PBS（磷酸盐缓冲液）30 ml。 MBP 2.4 mg 通过 Amylose 亲和层析纯化。 BCG 50 mg/只 两支。 免疫方法： MBP：50μg/只，BCG：3 mg/只，每隔 7 天免疫一次，第二次免疫不加 BCG。鼠颈背部六点，腹股沟二点皮下注射，每只鼠液体总量 400μl。 免疫日期：11月2日第一次，11月9日第二次。 小 鼠 免 疫 肿 瘤 接 种 细胞培养：复苏 Leiws 肺癌细胞，用IMDM 液洗两次后， 在含 10% 新生牛血清，100 U/ml 青霉素，100 U/ml 链霉素的 IMDM 培养液，5% CO2 孵箱 37℃ 培养，收 集 4.5 x 107个细胞。 接种肿瘤细胞：20 只 C57 小鼠背部皮下注射生理盐水， 21 只注射 Leiws 肺癌细胞，2 x 106/只，观察肿瘤生 长情况。 接种时间：在第二次免疫后3天注射肿瘤细胞。 学生分组与安排 实验共分 7 个组，每组 6 人，每人一只鼠。 前 3 号做 ELISPOT，在超净台内操作 后 3 号做流式细胞术并检测，在超净台外操作 1-4 组在 211 室 5-7 组在 214 室，作流式的同学细胞加封闭液固定后，回211室。 5-7 组每组杀完鼠后，分别集中放在 3 个塑料袋中收回。 ELISPOT 操作步骤贴在超净台上。 流式细胞术操作步骤看幻灯。 酶联免疫斑点试验,Enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT 实 验 目 的 通过检测分泌 IFN-γ 的抗原特异性 T 细胞频数，确定抗原特异性 Th1 细胞的活化。 实 验 原 理 最灵敏、最有效的直接离体检测抗原特异性 T 和 B 细胞的方法。 可用于检测特异性抗体分泌细胞和细胞因子分泌细胞。 MBP 0.7 mg/ml,40μl：配成 50 μg/ml RPMI1640 50 ml ConA 50 μg/ml 200μl 细胞计数液 (3%醋酸溶液）100 ml 小鼠：实验当天从动物室取回 微量移液器 20μl，微量移液器 高压灭菌吸水纸 1 盒 细胞计数板 14 块，每组两块 游标卡尺 1 个 废液缸1个 超净工作台 6 个 CO2细胞培养箱 实验材料 2 —— 每个超净台内的试剂与器材：5-7 组 （214，2 个超净台） 10% FCS + RPMI1640 50 ml X 1 PBS 50 ml X 1 淋巴细胞分层液 5 ml， 1 ml/管分装入 5支玻璃试管中。平皿 3 个，每个人半个。 4 个镊子，2 把剪刀 200 目钢网 6 个， 5 ml 刻度吸管 2只， 20μl、200μl、1000μl 加样器各两把 20μl 、200μl、1000μl加样器头各 1 盒 1.5 ml EP 管 一盒 记号笔 2 支、废液缸 1 个、酒精棉球1 盒 大小胶帽各两个 一、小鼠脾脏淋巴细胞分离 淋巴细胞分离操作步骤 1、处死小鼠，进入超净台。 2、将装好 1 ml 淋巴细胞分层液的玻璃试管编号，取 3 ml RMPI1640 培养液放入平皿中，放入钢网。 3、取脾脏放在钢网上研磨，摇动平皿，使细胞充分进入液体中，制备细胞悬液。 4、然后用 1 ml 加样器取 2 ml 脾细胞悬液轻轻置于分层液上。 5、1800 转，室温离心 15 分钟。 6、用毛细管吸上清弃去，尽量吸取毛玻璃层，放入 1.5 ml EP 管。 7、用 1 ml 加样器加入 PBS 1 ml 悬浮细胞，1500 rpm 离心 5 分钟. 8、在超净台中用 1 ml 枪尖吸取上清弃去，再加入 PBS 1 ml 1500 rpm 离心 5 分钟，弃去上清。 9、用 1 ml 加样器加入 1 ml 培养液悬浮细胞，用 200μl 加样器取 50 μl 加入另一 EP 管中，细胞计数。 10、调细胞浓度 3 x 10 6/ml 制备 1 ml 细胞悬液备用。 二、接种细胞 操作步骤 1、预包被板活化：加入 200μl 的 RPMI 1640 培养基,室温 静置 10 min，倾倒。（由教师完成） 2、加细胞：每孔加入 3 x 105 个细胞，100μl