过氧化氢酶固体脂质纳米粒的制备及稳定性分析-preparation and stability analysis of catalase solid lipid nanoparticles.docxVIP

摘 要摘要过氧化氢酶能够以过氧化氢为底物，通过催化一对电子的转移而最终将其分解为水 和氧气，从而能起到清除自由基的作用，在医药业上具有良好的应用前景。过氧化氢酶 作为一种蛋白类药物，自身存在诸多的缺陷：稳定性差，在酸、碱或酶的作用下易失活； 分子量大，常以多聚体形式存在，难以通过胃肠道豁膜细胞，导致吸收屏障的产生；使 用不便，一般只能注射给药；体内半衰期短，消除快，无法充分发挥其疗效；在体内只 与特定的受体结合而起作用，受体在组织的分布特性会显著影响药效。为了克服其上述 缺点，本课题采用固体脂质纳米粒作为载体对过氧化氢酶进行包载，对其工艺进行优化， 制备出包封率高、粒子稳定的脂质体，并对过氧化氢纳米脂质体的释放性能以及释放出 的过氧化氢酶与原样过氧化氢酶的结构进行了比较。采用多重乳状液（W/O/W）法进行制备。通过单因素试验和响应面试验，对其制备 工艺进行了优化。首先，以酶活为评价指标综合考虑乳化效果，考察有机溶剂和乳化方 式的影响，结果表明以二氯甲烷/丙酮（1/1）作为有机溶剂，超声两步乳化时间分别 20s 和 30s，效果最好。其次，以包封率为指标，在单因素实验基础上通过响应面设计考察 了内相乳化剂浓度、外相乳化剂浓度和第二相体积比的影响，得到最佳工艺参数：内相 乳化剂浓度 15.24%，外相乳化剂浓度 1%，第二相体积比 1:4。在上述最佳条件下，以 三棕榈酸甘三酯为固脂基质，所得样品包封率达到 74.51%，载药量为 3.58%。三个因素 对包封率的影响：外相乳化剂浓度＞第二相体积比＞内相乳化剂浓度，且第二相体积比 与外相乳化剂浓度具有显著的交互作用。在最佳工艺条件下，对三棕榈酸甘油酯及单硬脂酸甘油酯作为基质对包封率及粒子 形态的影响进行了分析，结果表明以三棕榈酸甘三酯得到的产品粒子形貌为球型、形态 较为均一、粒子稳定，但以单硬脂酸甘油酯制备得到的产品包封率和载药量较高。在最佳工艺条件下，对三棕榈酸甘油酯及混合脂质（三棕榈酸甘油酯/MCT）对包 封率、粒子分布及释放稳定性的影响进行了比较分析，结果表明加入少量 MCT（5%） 有利于提高包封率（81.40%）和载酶量（3.89%），并对粒径、电位分布无太大影响。体外释放研究表明 1.5%的甘氨酸能作为稳定剂，MCT 的加入能加快初期释放速率， 为体内迅速起效并维持较长平稳的血药浓度的治疗目标，开辟了一种制剂学的新手段。 将其释放曲线进行模型拟合，均符合 Higuchi 方程，表明体外释药性能符合长效制剂特 征。对释放出的过氧化氢酶与原样过氧化氢酶进行酶活测定、远紫外-圆二色光谱分析 和 SDS电泳，结果表明酶活力没有大的改变；其二级结构α-螺旋的含量基本不 变，而β-折叠和β-转角的含量有所差别，存在着β-折叠向β-转角转变的过程，故整 个过程酶的二级结构并未遭到破坏；电泳结果表明酶的亚基结构没有变化。关键词：过氧化氢酶；固体脂质纳米粒；多重乳状液；包封率；粒子形态；粒子分 布；释放性能；二级结构AbstractAbstractCatalase has a good prospect in the pharmaceutical industry, because it could eliminate free radicals in vivo through transfer hydrogen peroxide into water. However, as a therapeutic protein, its poor stability and easily inactive in acid, alkali and enzyme conditions, the half-life in vivo is short, and it does not possess the required physicochemical properties to be absorbed at their target sites. To overcome these disadvantages and improve its performance and get a carrier system that have high entrapment efficiency, stable particle and sustained release behavior, this paper chose the solid lipid nanoparticles as the carrier to encapsulate catalase.Nanoparticles were prepared by the double emulsion method (w/o/w) and sol