大学分子生物学经典课件第七章 分子生物学的研究方法.ppt

第七章 分子生物学研究方法 第一节 重组DNA技术回顾 一、重组DNA技术发展史上的重大事件 但是： 当时由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。随着DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展。 重组DNA技术（recombination）： ????? 是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。 二、基因克隆的载体 克隆用载体：是指具备自我复制能力的DNA分子。 常见的分子克隆载体有：病毒、噬菌体、质粒。 载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 三、基因克隆的操作 1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段； 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。 （二）种类 1) 按凝胶材料分: 聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳 2) 按电泳装置分: 水平式/琼脂糖凝胶; 竖式/聚丙烯酰胺凝胶 3) 两种方法比较：分离效果和分离范围; 操作难易 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 二、细菌转化 细菌转化（transformation）是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化的DNA菌株叫供体菌株，接受转化的DNA菌株叫受体菌株。 目前常用的转化方法有CaCl2法(化学转化法)和电转化法。 四、实时定量PCR 实时定量PCR技术：指利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的累积速率绘制动态变化图，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，从而测定终端产物的丰度。 非序列特异性的DNA结合的荧光探针 特异性的荧光探针 特异性的荧光探针是把荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上形成荧光标记的DNA探针。通过探针与PCR产物特异性的结合，在PCR过程中可对产物实现实时、定量检测。 TaqMan探针是一小段被设计成可以与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA（一般为5~50 bp），并且该单链DNA的5’和3’端带有短波长和长波长两个不同荧光基团。 当探针单独存在时，由于荧光共振能量转移的作用而发生荧光猝灭。在PCR过程中，由于TaqDNA酶的5’-3’外切酶活性的作用，使探针的5’端的基团被切断，加大了荧光基团间的的距离，被切下来的荧光基团恢复荧光。 一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此，Taqman探针检测的是积累荧光。 相对定量（两个样本中的基因表达水平进行比较 ） （图5-12） 五、基因组DNA文库构建 是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。 基因组DNA文库的类型 根据所选用的载体可以分为：质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。 基因组DNA文库构建的程序 ① 载体DNA的制备； ② 基因组DNA的提取； ③ 基因组DNA的部分酶切、分离与回收； ④ 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ⑤ 重组克隆的挑选和保存。 第三节 RNA基本操作技术 一、总RNA的提取 四、cDNA文库 将某种细胞的全部mRNA通过逆转录合成cDNA，与载体连接，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为cDNA 文库。cDNA文库具有组织细胞特异性。 五、基因文库的筛选 1、核酸杂交法 2、PCR筛选法 1）、设计特异性引物； 2）、将文库保存在多孔培养板上，对每个孔进行PCR扩增； 3）、对阳性孔进行稀释至次级孔，再对每个孔进行PCR扩增，直至鉴定出与目的基因对应的单克隆。 3、免疫筛选法 适用范围：表达文库 第四节 SNP理论及应用 SNP，中文翻译为单核