第十章蛋白质的研究方法与原理.pptx

第十章 蛋白质的研究方法 与原理 第一节 概 述 一、蛋白质分离纯化的一般程序 ①材料的选择和预处理（如动物组织要去除结缔组织、植物种子先行去壳和除脂、微生物需将菌体与发酵液分开等）； ②细胞的破碎（有时需分离细胞器）； ③提取； ④纯化(包括盐析，有机溶剂沉淀，有机溶剂提取、吸附、层析、超离心及结晶等)； ⑤浓缩、干燥及保存。 二、蛋白质纯化的注意事项 ①尽量减少分离纯化的步骤，缩短操作时间，维持低温，使用温和的溶剂，操作也要温柔； ②提取液不要太稀，蛋白浓度维持在μg/ml～mg/ml； ③选择合适的缓冲溶液和pH，避免与目标蛋白pI相同，防止蛋白质的沉淀； ④使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解； ⑤在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA酶，降解DNA，防止DNA对蛋白的污染； ⑥在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/L二硫苏糖醇（DTT） (或β-巯基乙醇），防止含巯基的蛋白质被氧化； ⑦避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性； ⑧使用灭菌溶液，防止微生物生长。 三、蛋白质纯化的一般设计原则 ①在材料选取上，尽可能选取来源方便、成本低、易操作的组织或细胞，其中目标蛋白的含量和活性要尽可能高、可溶性和稳定性尽可能好； ②建立一个快速、准确、具有良好特异性和重现性的蛋白活性检测方法。 ③遵循先粗分再细分的原则，即先利用目标蛋白的某一种理化特性，采用最简单的方法去除最主要