龟鳖类系统进化及蛇鳄龟养殖群体的遗传多样性分析-systematic evolution of turtles and turtles and analysis of genetic diversity of crocodilian turtle breeding population.docxVIP

龟鳖类系统进化及蛇鳄龟养殖群体的遗传多样性研究摘 要龟 鳖 类 动 物 隶 属 于 脊 索 动 物 门 （ Chordate ）、 脊 椎 动 物 亚 门 （ Subphylum Vertebrata）、爬行纲（Reptilia）、龟鳖目（Testudines），是爬行动物中十分特化的一 个类群。由于生态平衡破坏、环境污染以及人为滥捕等因素的影响，许多龟鳖类动 物特别是珍稀物种的野生资源急剧减少，甚至濒临灭绝，种质资源也面临严重危机。 出 于 为 龟 鳖 类 物 种 保 护 措 施 的 制 定 提 供 理 论 依 据 以 及 了 解 蛇 鳄 龟 （ Chelydra serpentina）种质资源状况的目的，本研究应用线粒体基因以及核基因对部分龟鳖类 进行了系统进化关系的研究，并利用微卫星 DNA 对蛇鳄龟的养殖群体进行了遗传 多样性分析。主要研究结果如下：（1）基于线粒体基因序列研究龟鳖类的系统进化关系采用 PCR 扩增和测序的方法，获得蛇鳄龟的 12S rRNA、16S rRNA 和 COⅢ序 列，并分别结合 NCBI 中其他龟鳖种类的同源性序列进行比对分析。比对后得到 394 bp 的 12S rRNA 一致序列、544 bp 的 16S rRNA 一致序列以及 757 bp 的 COⅢ一致 序列。12S rRNA、16S rRNA 序列合并得到联合序列，对其进行分析，其中可变位 点 327 个，序列总变异率为 34.9%，简约信息位点 222 个，单变异多态位点 105 个。 T、C、A、G 的平均含量为 23.6%、24.1%、33.5%、18.7%。A+T 含量为 57.1%， G+C 含量为 42.8%。在 327 个可变位点中，转换数为 61，颠换数为 24，转换/颠换 比率（R）为 2.53。COⅢ一致序列含有可变位点 324 个，序列总变异率为 42.8%， 简约信息位点 230 个；T、C、A、G 的平均含量分别为 27.5%、26.6%、30.8%、15.1%， A+T 含量（58.3%）高于 G+C 含量（41.7%），转换/颠换比率（R）为 2.62。基于 Kimura 双参数模型计算龟鳖类种间、属间、科间遗传距离，并采用邻接（NJ）法、 最大简约（MP）法和最大似然（ML）法构建分子系统进化树。基于 12S rRNA/16S rRNA 联合序列拟水龟属间的遗传距离为 0.021~0.060，平均为 0.467；淡水龟科 8 属之间的遗传距离为 0.022~0.110，平均为 0.0724；曲颈龟亚目 7 科（除平胸龟属外） 间的遗传距离为 0.071~0.123，平均为 0.105。基于 COⅢ序列的淡水龟科 4 个属间 的遗传距离为 0.090~0.153，平均为 0.129；曲颈龟亚目 5 个科之间的遗传距离为 0.150~0.207，平均为 0.177。结合构建的系统进化树得出以下结论：淡水龟科与陆 龟科具有较近的亲缘关系，而与龟科的亲缘关系较远；应将龟亚科、淡水龟亚科分 别提升为龟科、淡水龟科，并将大头乌龟、中华花龟并入拟水龟属；平胸龟应从鳄 龟科中分离出来，独立自成平胸龟科。（2）基于核基因序列研究龟鳖类的系统进化关系 用PCR扩增和测序的方法，获得蛇鳄龟的HNF-1α序列，并结合NCBI中其他龟鳖IIIII种类的同源性序列进行比对分析。比对后得到769 bp的HNF-1α一致序列。其中含有变异位点112个，变异率为14.6%，简约信息位点67个；T、C、A、G的平均含量为26.1%、23.1%、28.3%、22.6%，A+T含量为54.4%，G+C含量为45.7%，转换/颠换比率(R)为1.42。基于Kimura双参数模型计算龟鳖类种间、属间、科间遗传距离，并采用邻接法、 最大简约法和最大似然法构建分子系统进化树。结果显示：龟科9属间的遗传距离为 0.003~0.051，平均为0.016；鳄龟科、龟科、淡水龟科3科间的遗传距离为0.044~0.067， 平均为0.053。综合遗传距离和系统进化树，支持将龟科重新划分为龟亚科和鸡龟亚 科两个分支的观点；鳄龟科和海龟科亲缘关系较近，大鳄龟（Macroclemys temminckii） 和蛇鳄龟可能同为一属。（3）蛇鳄龟养殖群体的遗传多样性分析利用磁珠富集法，以生物素标记的(CA)15 为探针，构建了蛇鳄龟微卫星富集文 库。通过 PCR 法从富集文库中共筛选出 70 条微卫星序列，一共设计了 48 对微卫 星引物，采用 PCR 扩增的方法从中筛选出 36 对适用引物，对一个蛇鳄龟养殖群体 进行遗传多样性分析。结果表明，36 个位点获得的等位基因数从 2~9 不等，平均为 4.361，有效等位基因为 1.461~7.767，平均为 3.49