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Molecular cloning 工具酶（Tool Enzyme） 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 碱性磷酸酶 多核苷酸激酶 末端转移酶 * * LOGO 分子克隆 生物化学教研室 徐志伟 概念 1 发热的原因 2 发热的发病机制（重点） 3 分期与热代谢特点（重点） 4 代谢与功能的改变 5 防治的病理生理学基础 6 主要内容 ＆克隆化(cloning): 获取大量单一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，也称无性繁殖。 ＆ 克隆(clone): 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 目 录 分子克隆的概念 按照人的意愿，在体外将制备的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝，此过程称为分子克隆，也称基因克隆或DNA克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。 基因工程 上游技术：分子克隆 下游技术：基因表达 Werner Arber Daniel Nathans Hamilton O. Smith The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978 was awarded jointly to Werner Arber, Daniel Nathans and Hamilton O. Smith for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics. 限制性核酸内切酶 ①定义 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 GGATCC CCTAGG GATCC G G CCTAG + Bam HⅠ 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 ②命名： Hin dⅢ 属 种 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 ③分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型） 作用 Ⅰ Ⅰ Ⅱ Ⅱ ④作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。 Ⅱ类酶识别序列特点—回文结构(palindrome) GGATCC CCTAGG 识别序列一般为4～6个碱基对，并以切割序列的正中作为轴心，成180°反向重复,这种结构也称为回文结构。 GTC CAG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 切割方式及切割结果： 交错切割 对称切割 粘端切口 5’突出末端 （ 5’- cohesive end ） 3’突出末端 （ 3’- overhang tail） Bam HⅠ G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG 粘端切口 平端切口 Blunt end 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同工异源酶。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + BstⅠ 同工异源酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端(compatible end)。 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A 同尾酶 *