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淫羊藿总黄酮生物转化过程分析 　　[摘要] 该文旨在研究淫羊藿总黄酮在体外水解酶作用下的生物转化过程。主要采用蜗牛酶水解淫羊藿总黄酮，用HPLC测定总黄酮中主要黄酮的转化。数据结果显示已知主要黄酮成分淫羊藿苷，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C都在1～2 h内分别完全转化为宝藿苷Ⅰ，箭藿苷A，箭藿苷B和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ，随着水解时间的延长，各转化产物被继续水解。因此可得出结论，蜗牛酶在37 ℃，pH 6.0的Hank′s平衡盐溶液中，2 h内能将淫羊藿主要总黄酮转化为次级苷或苷元，且其酶解产物与肠道代谢产物相一致。 　　[关键词]淫羊藿总黄酮；蜗牛酶；生物转化 　　淫羊藿是传统的补肾中药，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的作用[1]。淫羊藿中黄酮成分是主要活性成分，其中8-异戊烯基取代黄酮苷是主要代表活性黄酮，主要有淫羊藿苷，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C和宝藿苷等[2]，化学结构见图1。淫羊藿黄酮苷在肠道的吸收较差[3]，水解是淫羊藿黄酮苷生物转化的起始步骤，去糖基化使得糖苷易于在肠道扩散和吸收。因此口服淫羊藿黄酮，主要以肠道代谢产物（次级苷或苷元）的形式被吸收而发挥疗效[4-5]，且据文献报道肠道代谢产物宝藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元的抗骨质疏松等的生物活性更强[6-7]。但由于人体肠道存在的水解酶（肠道黏膜酶和肠道菌酶）会因人种、年龄、疾病而有所差异[8-9]，因此会影响淫羊藿黄酮苷的水解进而影响其吸收和疗效的发挥。在体外选择高效安全的淫羊藿黄酮苷水解酶，将其加入淫羊藿总黄酮中口服，可以增强淫羊藿总黄酮肠道水解功能，是促进淫羊藿总黄酮口服吸收，增加其生物利用度，提高药效的有效途径之一。 　　蜗牛酶是从蜗牛的嗉囊和消化道中提取的一种混合酶， 目前已明确其含有纤维素酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等20多种酶， 具有很强的生物转化能力[10]。课题组前期研究表明蜗牛酶可以水解淫羊藿苷[11]，且其代谢产物与肠道代谢产物一致，因此本研究采用蜗牛酶水解淫羊藿总黄酮，研究主要已知黄酮和未知黄酮的生物转化情况，为构建新型的淫羊藿总黄酮仿生酶解给药系统提供前期的研究基础。 　　1材料 　　Agilent 1200型高效液相色谱仪（DAD检测器，四元泵，美国Agilent公司）；数显气浴恒温振荡器（金坛市双捷实验仪器厂）；METTLER AL204 1/10万天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）。 　　蜗牛酶（上海源叶生物科技有限公司）；淫羊藿苷，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C和宝藿苷Ⅰ对照品（上海源叶生物科技有限公司，纯度98%）；淫羊藿苷元对照品（自制，纯度?98%）；乙腈为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。 　　淫羊藿购自吉林敦化，经南京中医药大学吴德康教授鉴定为朝鲜淫羊藿。 　　2方法与结果 　　2.1HPLC测定淫羊藿主要黄酮的分析方法建立 　　2.1.1色谱条件 Zorbax SB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相乙腈（A）-水（B），梯度洗脱，0～15 min，10%～25%A，15～38 min，25%A，38～61 min，25%～71%A，61～75 min，71%～100%A；流速1.0 mL?min-1；检测波长270 nm；柱温30 ℃。 　　2.1.2对照品溶液的制备 精密称取淫羊藿苷5.33 mg，朝藿定A 8.42 mg，朝藿定B 9.05 mg，朝藿定C 8.26 mg，宝藿苷Ⅰ5.26 mg，淫羊藿苷元8.19 mg，加无水乙醇溶解稀释至10 mL，作为储备液。 　　2.1.3供试品溶液的制备 取转化后的混悬液适量，加无水乙醇终止酶解反应，摇匀，离心后即得。 　　2.1.4标准曲线的绘制 精密量取淫羊藿苷，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，宝藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元储备液适量，加无水乙醇稀释成一定浓度的对照品溶液。所含淫羊藿苷的质量浓度分别为1.7，3.3，6.7，13.3，26.6，53.3，106.6 mg?L-1，所含朝藿定A的质量浓度分别为2.6，5.3，10.5，21.0，42.1，84.2，168.4 mg?L-1，所含朝藿定B的质量浓度分别为1.4，2.8，5.7，11.3，22.6，45.2，90.5，181.0 mg?L-1，所含朝藿定C的质量浓度分别为2.6，5.2，10.3，20.6，41.2，82.6，165.2 mg?L-1，所含宝藿苷Ⅰ的质量浓度分别为3.3，6.6，13.2，26.3，52.6，105.2 mg?L-1，所含淫羊藿苷元的质量浓度分别为5.1，10.2，20.5，41.0，81.9，163.8 mg?L-1。分别精密吸取各对照溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积。以检测质量浓度（x，mg?L-1）为横坐标，峰面积