酵母核糖核酸的提取与组分鉴定1.pptVIP

11、定磷试剂 (1)17％硫酸，将17m1浓硫酸(比重1. 84)缓缓加到83ml水中。 (2)2．5％钼酸铵溶液：2．5g钼酸铵溶于100m1水中。 (3)10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100ml水中，贮棕色瓶内保存。 临用前将上述三种试剂与水按如下比例混匀：(1):(2):(3):H2O= 1:1:1:2（v/v），溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失效。 实验六 酵母核糖核酸的提取 和组分鉴定 实验目的　 学习稀碱法提取RNA，了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 实验原理 由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备RNA的方法也各有不同，通常根据材料的性质以及制备的要求来选择相应的提取方法。由于酵母中RNA含量较高， DNA 较少，在实验室常用酵母作为提取RNA的材料, 一般使用浓盐法、稀碱法来提取变性的RNA ，若要制备具有生物活性的RNA，实验室常用苯酚法。 本实验采用稀碱法提取制备RNA,其原理是利用稀的NaOH溶液，将细胞裂解， RNA溶于碱性提取溶液中，升高温度使蛋白质变性，将蛋白质与核酸分离，然后通过离心除去菌体等残渣，在上清液（碱提取液）中加入酸性乙醇溶液使解聚的RNA沉淀，即得到RNA的粗制品。 核糖核酸中含有核糖、嘌呤碱，嘧啶碱和磷酸各组分，加硫酸煮沸可使其水解，在水解液中用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组分的存在。 仪器 研钵、锥形瓶、量筒、布氏漏斗及抽滤瓶、SHZ-D循环水式真空泵、电子分析天平、离心机、恒温水浴箱等。 材料与试剂 1、活性干酵母 2、0. 04mol/L氢氧化钠溶液 3、酸性乙醇溶液 4、95％乙醇 5、乙醚 6、1.5M硫酸 7、浓氨水 8、0.1mol/L硝酸银溶液 9、三氯化铁浓盐酸溶液 10、苔黑酚乙醇溶液 实验步骤 一、酵母中RNA粗制品的制备 1、提取： 将5g酵母悬浮于30ml 0.04 M NaOH溶液中（先加15ml），并在研钵中研磨均匀，将悬浮液转移到锥形瓶中，在沸水上加热30分钟(期间不时搅拌)。 2、分离 上述提取液取出，冷却后转入大离心管内，以4000r/min离心10min，使提取液与菌体残渣等分离。 3、沉淀RNA 将上清液缓缓倾入（边搅拌）15ml酸性乙醇溶液中，待核糖核酸沉淀完全后，离心5min（4000rpm）。 4、洗涤和抽滤 用95%乙醇15ml洗涤沉淀，离心5min（4000rpm）弃去上清液，沉淀再用15ml无水乙醚拌匀后，布氏漏斗中抽滤（用乙醚冲洗2-3次），至沉淀抽干，即得RNA粗制品。 布氏漏斗抽滤装置 二、待测样液的制备： 取适量提取的RNA粗制品，加入1.5mol/L的H2SO4 10ml ，在沸水浴中加热10分钟后制成水解液，进行相关组分的鉴定。 三、组分的鉴定： 1、 嘌呤碱：取水解液1ml加入过量（1滴管）的浓氨水，然后加1滴管0.1 M AgNO3溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物沉淀。 2、 核糖：取1支试管加入水解液1ml，加FeCl3浓盐酸溶液2滴管和苔黑酚乙醇溶液5滴，放沸水浴中，注意观察溶液是否变成绿色，说明核糖是否存在。 3、 磷酸：取1支试管，加入水解液1ml和定磷试剂1滴管，在沸水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在。 结果与讨论： 1、用稀碱法提取RNA，如何得到高提取率的RNA粗制品? 2、本实验RNA组分是什么?怎样验证的? 在酵母中RNA(2.67 ％～10％)比DNA的含量高得多，DNA则少于2％(O．03％～O．516％)，核酸经水解可得到很多核苷酸，因此核苷酸是核酸的基本单位。核酸就是由很多单核苷酸聚合形成的多聚核苷酸。核苷酸可被水解产生核苷和磷酸，核苷还可再进一步水解，产生戊糖和含氮碱基。 * 放入布氏漏斗中，用少量乙醚湿润滤纸，开启真空泵，使滤纸贴紧漏斗，将沉淀及溶液全部转移至布氏漏斗内；再用15mL 95%的乙醇洗涤离心管，淋洗滤渣。 放入布氏漏斗中，用少量乙醇湿润滤纸，开启真空泵，使滤纸贴紧漏斗，将沉淀及溶液全部转移至布氏漏斗内；再用15mL 95%的乙醇洗涤离心管，淋洗滤渣。 放入布氏漏斗中，用少量乙醇湿润滤纸，开启真空泵，使滤纸贴紧漏斗，将沉淀及溶液全部转移至布氏漏斗内；再用15mL 95%的乙醇洗涤离心管，淋洗滤渣。  RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3， 5-二羟甲苯反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁和氯化铜作催化剂，地衣酚反应特异性较差，凡是戊糖均有此反应。戊糖或含戊糖的物质对本法有干扰。 戊糖或含戊糖的物质对本法有干扰。 戊糖或含戊糖的物质对