原理应用探针设计与应用实例.pptVIP

内 容 提 纲 荧光定量PCR原理及应用 荧光定量PCR实验引物/探针设计及实验条件优化 Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪 常规核酸定量方法 Southern 杂交 Northern 杂交 原位杂交 传统 RT-PCR 半定量 PCR Real time PCR 定义 利用荧光信号对PCR反应的过程进行实时监控 目的 对起始模板进行定量 优点 灵敏, 重复性, 动态范围宽, 高通量 原理 C(t)值与起始模板浓度的对数成比例 应用 肿瘤，微生物检测，SNP等 荧光化学原理 SYBR Green ITM TaqMan? / TaqMan-MGB? Molecular Beacons MGB EclipseTM Probes Lux? primers ScorpionsTM Amplifluor Q-Zyme Others... 什么是C(t)值 Non-Quantitative Nature of PCR Endpoint Products 传统的定量方法 Real-time 定量 定量PCR是如何定量的？ 荧光定量PCR应用 特异核酸（基因）定量 RNA (cDNA) 基因表达差异分析 基因芯片结果验证 DNA 病原体定性与定量 GMO (遗传改良组织)检测 序列特异性 等位基因分型, SNP 检测 应用之一：病原体检测与定量 如何确定标准品的量 标准品是通过某种方法制备得到的已知拷贝数的含有目标片段的核苷酸序列 通常通过紫外定量等方法测得浓度C(ng/uL) 通过核苷酸的相对分子量和标准品序列信息估算出标准品的分子量B 这样拷贝数A(copy/uL)为： A=C/B*6.02E+14 应用之一：病原体检测与定量 应用之一：病原体检测与定量 基因表达相对定量分析实例 采用SYBRGreenI的方法 研究Mal基因在食管癌中的表达状况；采用看家基因GAPDH作为内参 样品采集，新鲜食管癌标本和远端正常组织 抽提总RNA，电泳检测质量通过紫外分光光度计检测RNA含量 取500ng的总RNA参加反应合成cDNA 标准品的准备 选择某种已知表达较高的组织或细胞作为标准品来源 提取总RNA，样本处理方法同前 经梯度稀释：1：10；1：100；1：1000；1：10000；1：100000 并自己给稀释的标准品定义数值：10000，1000，100，10，1等 两条探针分别针对不同等位基因 荧光定量PCR仪的硬件条件 荧光定量PCR仪应满足的要求 光源的光谱范围宽广，能激发不同的荧光染料 能分开不同荧光素的激发光与发射光波长 能检测的灵敏度与动态检测范围 准确的温度控制和良好的孔间温度均一性. 荧光定量PCR原理及应用 荧光定量PCR实验引物/探针设计及实验条件优化 Stratagene Mx3000P荧光定量PCR仪 QPCR Assay Optimization Target/Amplicon Choice Target size: 50-150 bp for dual-labeled probes (Taqman) 200-400 bp for SYBR If using a cDNA template, span introns to avoid genomic DNA contamination. Try to avoid repetitive or highly structured regions (CpG islands and control regions at the 5’end tend to form complex structures). QPCR Primer Properties Use the same target annealing temperature for all your primers to favor multiplexing in the future and run single thermal profile Typically 55-60°C (with 1°C temp difference) Avoid G/C clamps at the 3’end. If requested by the software, use 100 mM monovalent cation and 5 mM Mg++ for probes, 2.5 mM for SYBR. Always BLAST your primers. Dual-labeled Probe Design Tm 10°C higher than primers. 35-65% G/C;more Cs than Gs. Avoid runs of 3+