2总糖与还原糖的测定.pptVIP

实验二 总糖和还原糖的测定 ──3,5－二硝基水杨酸法 目的要求 掌握还原糖和总糖的测定原理 学习用比色法测定还原糖的方法 双糖 麦芽糖 （maltose） 乳糖 （lactose） 蔗糖（sucrose） D-葡萄糖部分 D-葡萄糖部分 D-葡萄糖部分 D-半乳糖部分 D-葡萄糖部分 D-果糖部分 多糖 均多糖：淀粉、纤维素等 杂多糖：透明质酸等 非还原糖，难溶于水，不溶于有机溶剂，在酸性条件下水解可生成寡糖或单糖 实验原理 在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。 实验内容 葡萄糖标准曲线的制备； 样品（藕粉）中还原糖的提取和含量测定； 样品（藕粉）中总糖的水解和含量测定。 1、葡萄糖标准曲线制作 1、取6支1. 5 cm×15 cm试管，按下表加入1 mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。 管号 葡萄糖标准液（ml） 蒸馏水(ml) 葡萄糖含量(mg/ml) A540 0 0 1 0 ? 1 0.2 0.8 0.2 ? 2 0.4 0.6 0.4 ? 3 0.6 0.4 0.6 ? 4 0.8 0.2 0.8 ? 5 1 0 1 2、在上述试管中分别加入DNS试剂2 ml，于沸水浴中加热2 min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9 ml，摇匀，在540 nm波长处测定光吸收值。以葡萄糖含量（mg/ml）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 用两个比色皿测定。 一个放空白对照；另一个测定样品。 样品测定浓度从低到高。 2、样品中还原糖的提取 准确称取1g藕粉，放在100 ml烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加入约40 ml蒸馏水，混匀，于50℃恒温水浴中保温20 min，不时搅拌，使还原糖浸出。将提取液转入50 ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。混匀，过滤。收集滤液，用于还原糖测定。 3、样品总糖的水解及提取 准确称取0.5 g藕粉，放在大试管中，加入6 M HCl 10 ml，蒸馏水15 ml，在沸水浴中加热15 min，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后，转入烧杯中，加入1滴酚酞指示剂，以6 M NaOH溶液中和至溶液呈微红色，定容到50 ml，取5 ml再次定容至50 ml，然后过滤，取滤液用于总糖测定。 4、样品中含糖量的测定 1、取7支1.5 cm×15 cm试管，分别按下表加入试剂： 项目 空白 还原糖 总糖 管号 0 1 2 3 4 5 6 样品溶液（ml） 1 1 1 1 1 1 1 3,5-二硝基水杨酸试剂（ml） 2 2 2 2 2 2 2 A540 ? ? ? ? ? ? ? 2、加完试剂后，于沸水浴中加热2 min进行显色，取出后用流 动水迅速冷却，各加入蒸馏水9 ml，摇匀，在540 nm波长 处测定光吸收值。测定后，取样品的光吸收平均值在标准 曲线上查出相应的糖含量。 5、计 算 按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量： 式中：C──还原糖或总糖提取液的浓度，mg/mL； V──还原糖或总糖提取液的总体积，mL； m──样品重量，g； 1000──mg换算成g的系数。 思 考 题 1. 比色时为什么要设计空白管？ 2.总糖和还原糖的提取有何不同？ 3. 若以葡萄糖标准曲线，测定1mg/ml麦芽糖（按还原糖测定），所测的浓度会有何不同？ 4. 如何测定可乐溶液中还原糖的浓度？ * 麦芽糖：由一分子α-D-葡萄糖的半缩醛羟基与另一分子α-D-葡萄糖C4上的醇性羟基缩去一分子水而通过α-1，4糖苷键结合而成的 乳糖：由一分子β-D-半乳糖的半缩醛羟基与另一分子葡萄糖C4上的醇性羟基缩去一分子水通过β-1，4糖苷键结合而成 蔗糖： 由一分子α-D-葡萄糖和一分子α-D-果糖通过两个半缩醛羟基缩去一分子水而成 由于麦芽糖和乳糖都保留了半缩醛羟基结构，因此都具有还原性，是还原二糖； 而蔗糖在缩合过程中丧失了半缩醛羟基，不具有还原性，是非还原糖 * 麦芽糖：由一分子α-D-葡萄糖的半缩醛羟基与另一分子α-D-葡萄糖C4上的醇性羟基缩去一分子水而通过α-1，4糖苷键结合而成的 乳糖：由一分子β-D-半乳糖的半缩醛羟基与另一分子葡萄糖C4上的醇性羟基缩去一分子水通过β-1，4糖苷键结合而成 蔗糖： 由一分子α-D-葡萄糖和一分子α-D-果糖通过两个半缩醛羟基缩去一分子水而成 由于麦芽糖和乳糖都保留了半缩醛羟基结构，因此都具有还原性，是还原二