p53在骨关节炎软骨组织中表达及与关节软骨细胞自噬关系研究.docVIP

p53在骨关节炎软骨组织中表达及与关节软骨细胞自噬关系研究 　　【摘要】 目的：研究p53在骨关节炎软骨组织中的表达及与关节软骨细胞自噬的关系。方法：对20例骨关节炎患者（OA组）及10例正常膝关节软骨组织（对照组），用实时定量PCR（real-time PCR）、免疫组化等方法检测p53及Beclin1在膝关节软骨中的表达与分布，并对两者进行相关性分析。结果：p53在OA组的表达明显高于正常对照组（P　　【关键词】 骨关节炎； 自噬； p53； Beclin1 　　骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种常见的慢性退行性关节病，其主要病理改变是关节软骨细胞的减少和软骨基质的降解，是致残致畸的主要原因之一[1]。OA软骨细胞的减少主要由于软骨细胞过度凋亡引起，引起OA软骨细胞过度凋亡的原因一直是近年来的研究热点。随着自噬现象的发现及其与凋亡关系研究的不断深入，有学者发现自噬在OA软骨细胞中减弱，从而促进凋亡，但OA软骨细胞自噬减弱的原因并不清楚[2]。最新研究认为，抑癌基因p53是调控细胞凋亡和自噬的重要因子[3]。因此，本研究通过检测p53及自噬调节因子Beclin1在OA软骨细胞中的表达，探索OA软骨细胞自噬减弱的原因，为OA的基础及临床研究提供新的方向及思路，现报告如下。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 从2012年11月-2013年4月在西安交通大学医学院附属红会医院住院预接受膝关节置换手术治疗患者中，根据根据美国风湿病学会（ACR）2008年修订的OA诊断标准，通过病史、临床检查和X线平片等确诊OA患者共20例作为OA组。其中男6例，女14例，平均年龄（71.3±8.9）岁。同时收集无关节疾病史及肉眼病变的因外伤截肢、交叉韧带断裂、半月板损伤等行手术治疗的膝关节患者共10例作为对照组，其中男8例，女2例，平均年龄（42.4±6.7）岁，经病理学诊断关节病变，作为正常对照组。受试者均知情同意参加本实验并经过医学伦理委员会批准。两组受试者一般资料比较差异无统计学意义（P0.05），具有可比性。 　　1.2 主要试剂及方法 　　1.2.1 主要试剂 p53及Beclin1引物由南京金斯瑞公司合成，引物信息见表1；逆转录试剂盒购自加拿大Fermentas公司；SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ购自日本Takara公司；p53及Beclin1多克隆抗体购自中国台湾Abnova公司，即用SP免疫组化两步法检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 　　1.2.2 方法 30例新鲜标分为两部分：一部分立即放入4%多聚甲醛中固定，10%EDTA脱钙6、7周，常规脱水，石蜡包埋，以4～5 μm厚度连续切片。行常规HE染色外，按试剂盒内说明分别行p53及Beclin1免疫组织化学染色，用已知的阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照，经染色后，阳性信号呈黄褐色。每张切片随机选取5个高倍视野（×200），计算阳性染色细胞所占细胞总数的百分比；另一部分放入1‰DEPC水处理过的冻存管中浸液氮24 h后，转移到-80 ℃冻存，Trizol法提取软骨组织总RNA，经微量核酸/蛋白定量仪鉴定并定量后，根据Fermentas公司提供说明书进行逆转录，对逆转录产物进行扩增，反应结束后，立即进行熔解曲线分析，用于判定PCR反应的特异性，是否有非特异性扩增产物；琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物条带是否单一；内参照为β-actin，基因表达量采用ΔΔCt法进行计算。 　　1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，对数据进行方差齐性及正态性检验后，根据情况，两组间均数的比较用Mann-Whitney U检验或t检验；OA软骨细胞中p53与Beclin1基因水平表达量用Pearson或Spearman检验进行相关性分析以P 　　OA软骨细胞过度凋亡与凋亡基因过度表达有关[7]。p53是重要的抑癌基因，在转录水平上调促凋亡基因如Bax、PUMA和NOXA，下调凋亡抑制基因如Bcl-2的表达[8]。细胞质中的p53使 Bax诱导的MOMP增加[9]。NO表达增加、细胞外基质降解可以增加软骨细胞中p53的表达，进而诱导软骨细胞凋亡[10]。本研究也证实OA中p53无论在基因水平及蛋白表达水平均高于正常对照组，且主要分布在表层和中层，细胞质与细胞核均有表达。 　　研究发现，自噬参与了OA软骨细胞凋亡的调节。自噬通过降解蛋白及残余细胞器为细胞节约并提供能量，清除某些有害的蛋白来防止或减少由这些聚集蛋白所引起的细胞毒性，中和细胞的应激反应[11]。Beclin1是重要的自噬调节基因，它与Vps34形成的复合物可使磷脂酰肌醇磷酸化形成PI3P。PI3P招募并引导自噬相关蛋白定位，进而介导自噬体的成核[