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指纹图谱分析结合多指标成分定量用于六味五灵片质量评价 　　[收稿日期] 2013-12-09 　　[基金项目] 山东省自然科学基金项目（ZR2011HM080） 　　[通信作者] *刘宏明，主管中药师，主要从事中药质量的检验分析工作，Tel：（0533）3571051，E-mail：zbyjslhm@126.com 　　[摘要] 采用反相高效液相色谱法-二极管阵列检测器，以乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱，对20批六味五灵片中的6种成分进行同时分析测定，并对其指纹图谱进行研究。结果表明6种成分（特女贞苷、连翘苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素）分离良好，加样回收率在98.96%～100.5%，RSD小于2.0%；在特征指纹图谱研究中，以五味子酯甲为参照峰，共标定了25个共有峰，采用夹角余弦法、相关系数法、等权比率法对指纹图谱进行了相似度分析，分析的20批六味五灵片与共有模式之间具有良好的相似性，相似度均在0.95以上。G检验及聚类分析结果表明所建立的含量测定结合特征图谱分析方法可用于六味五灵片的质量控制。 　　[关键词] 六味五灵片； HPLC； 指纹图谱； 质量评价 　　六味五灵片由五味子、女贞子、连翘、莪术、苣荬菜、灵芝孢子粉组成，具有滋肾养肝、活血解毒的功能，主要用于治疗慢性乙型肝炎，获“中国肝类用药市场十大影响力品牌”称号，为山东世博金都药业有限公司独家品种。六味五灵片中含有的多种成分都具有良好的抗炎、抗病毒、抗肝纤维化、保肝作用，如特女贞苷、连翘苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素[1-5]。而原质量标准中只有五味子甲素的含量测定，测定成分单一，难以全面控制六味五灵片的质量。中药指纹图谱方法已广泛用于中药的质量控制[6-8]，这种方法所提供的色谱指纹特征信息比目前沿用的其他方法更加丰富、全面。中药复方制剂走向国际的前提条件之一就是需要应用色谱指纹图谱，控制中药复方制剂的质量[9]。因此本研究在建立六味五灵片主要指标性成分特女贞苷、连翘苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素含量分析方法的同时，还对20批六味五灵片进行了色谱特征谱的分析与探讨，为六味五灵片的内在质量控制提供了一种较为全面的分析手段。 　??1 材料 　　高效液相色谱仪（Agilent 1100型），包括DAD检测器（美国Agilent 公司）；高效液相色谱仪（SHIMADZU），包括SHIMADZU LC-20ATVP 泵，SHIMADZU SPD-20AVP紫外检测器，CTO-20A 柱温箱，SIL-20A 自动进样器；分析天平（METTLER AE 240）；超声波清洗器（KS-300E）。 　　特女贞苷（批号111926-201203，纯度96.4%），连翘苷（批号110821-201213，纯度95.3%），五味子醇甲（批号110857-201211，纯度99.9%），五味子酯甲（批号11529-200604，置五氧化二磷中减压干燥12 h以上，按100.0%计），五味子甲素（批号110764-201312，纯度99.6%），五味子乙素（批号110765-200205，置五氧化二磷中减压干燥12 h以上，按100.0%计）对照品均来源于中国食品药品检定研究院。甲醇、磷酸为分析纯，乙腈为色谱纯，超纯水为实验室自制。20批六味五灵片样品为市售，均为山东世博金都药业有限公司生产。 　　2 方法 　　2.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相0.1%磷酸（A）-乙腈（B），线性梯度洗脱程序：0～5 min，5% B；5～15 min，5%～18% B；15～28.5 min，18% B；28.5～50 min，18%～50% B；50～57 min，50%～55% B；57～67 min，55% B；67～72 min，55%～75% B；72～80 min，75%～85% B；80～90 min，85%～5% B。流速1.0 mL?min-1；柱温40 ℃；进样量10 μL；检测波长230 nm。6种成分理论板数均不低于40 000，对照图谱见图1。 　　1.特女贞苷；2.连翘苷；3.五味子醇甲；4.五味子酯甲；5.五味子甲素；6.五味子乙素。 　　图1 6种混合对照品的HPLC图 　　Fig.1 HPLC chromatogram of six mixed reference substances 　　2.2 溶液的制备 　　2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取特女贞苷对照品12.09 mg置10 mL量瓶中，加甲醇超声处理使溶解，加甲醇稀释至刻度，作为特女贞苷对照品贮备液（1.165 g?L-1）。同法